孙曼娜， 娄季武， 赵颖， 付有晴， 刘彦慧， 李亮

1东莞市妇幼保健院产前诊断中心(广东东莞 523000)； 2南方医科大学基础医学院医学遗传学教研室(广东广州 510515)

脊髓性肌肉萎缩症(spinal muscular atrophy, SMA)是一组儿童期仅次于假肥大性肌营养不良，居第2位的常见神经肌肉疾病，也是婴儿期最常见的致死性疾病，居所有致死性常染色体隐形遗传病的第2位。SMA在新生儿中发病率为1/6 000～1/10 000， 人群携带者频率约为1/50[1-3]。根据发病年龄和进程，SMA可以分为4种类型：SMA Ⅰ型，又称婴儿型，通常6个月前发病，不能独坐；SMA Ⅱ型，又称中间型，通常1岁半前发病，不能独立行走；SMA Ⅲ型，又称少年型，通常1岁半后发病，可以行走；SMA Ⅳ型，又称成年型，通常30岁后发病，症状较轻[4]。SMA的发病机制是由于染色体5q11.2～q13.3上的生存运动神经元基因(survival motor neuron gene,SMN)缺陷引起。人类基因组中有两个高度同源的SMN基因，SMN1和SMN2，其中，SMN1是致病基因。约96%的SMA Ⅰ～Ⅲ型患者为SMN1基因外显子(exon)7和8缺失纯合子或exon 7缺失纯合子，其中exon 7和8缺失纯合子约占90%，exon 7缺失纯合子约占10%[5-7]。因此SMN1基因exon7纯合缺失的检测对SMA患者的基因诊断具有重要意义。目前，已有多种方法用于SMA的诊断，例如，毛细管电泳法、多重连接依赖探针扩增法(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)、变性高效液相色谱法(denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)、限制性片段长度多态性法(restriction fragment lengthpolymorphism,RFLP)、等位基因特异PCR法(alleles specific amplification, ASA)、高分辨率熔解曲线分析法(high-resolution melting, HRM)等[8-12]，这些方法或者对仪器有特殊要求，或者需要PCR后操作而增加污染风险，因此，临床应用受到一定限制。本研究拟利用探针熔解曲线方法检测SMN1exon7和SMN2exon7拷贝数，建立一种简单快速的SMN1基因exon7纯合缺失检测方法。

1 资料与方法

1.1 病例样本

1.1.1 正常人样本 收集2018年1月在东莞市妇幼保健院产前诊断中心进行产前地贫基因筛查的孕妇或其丈夫外周血标本，共94例，年龄20～42岁，均无SMA临床相关病史。该部分样本用于检测体系的初步评价。

1.1.2 已知基因型样本收集 样本来自于2012年1月至2018年9月期间，在东莞市妇幼保健院产前诊断中心进行SMA基因产前或产后检测病例，共238例。其中外周血液标本232例，羊水标本5例，绒毛1例。经患者知情同意，抽取外周血2 mL，羊水10 mL，绒毛2支用于基因组DNA提取。所有样本均经荷兰MRC-Holland公司的MLPA试剂盒(P060-B2 SMA)检测，基因型已知。

1.1.3 仪器与试剂 SLAN-96S荧光定量PCR仪购自上海宏石公司；Phire Hot Start Ⅱ DNA聚合酶及配套PCR缓冲液、dNTPs等PCR试剂及测定DNA浓度用的NanoDrop 2000分光光度计购自美国Thermo Scientific公司；引物及探针由上海生工(Sangon)生物技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 血液基因组DNA采用厦门致善公司的Lab-820自动核酸提取仪进行提取。测定DNA浓度后，标本保存在-80℃冰箱备用，其中羊水和绒毛DNA均经STR分析排除母体组织污染。

1.2.2 引物和探针设计 利用Blast程序比对SMN1基因exon7和SMN2基因exon7序列，根据比对结果，利用primer 3软件设计一对通用引物SMN-F/SMN-R同时扩增两者序列，扩增区域包含2个序列差异位点c.840 (SMN1: C;SMN2: T)和c.835-45(SMN1: G;SMN2: A)。针对这两个差异位点，分别设计一个针对性的荧光探针用于熔解曲线分析基因分型，两个探针分别标记有不同荧光物质。其中c.840位点探针用于区分SMN1基因exon7和SMN2基因exon7，c.835-45位点探针用作内对照并验证c.840位点探针结果。利用在线oligo analyzer工具 (https://sg.idtdna.com/site/account/login?returnurl=%2Fcalc%2Fanalyzer) 评估碱基错配导致的探针温度(Tm)值变化。引物和探针信息见表1。

表1 引物和探针信息

1.2.3 荧光PCR扩增 参照文献报道的方法[13]，建立不对称PCR体系并对体系中的缓冲液、镁离子、引物、探针、dNTPs等成分的浓度进行优化。PCR反应体系为20 μL，包含50 ng 模板DNA，5 μL 5×buffer, 0.2 mmol/L dNTPs，10 pmol SMN-F引物，1 pmol SMN-R引物，探针各2.5 pmol，0.4 μL Phire Hot Start Ⅱ DNA聚合酶。PCR扩增参数为：起始变性98℃，3 min、50个循环：98℃，10 s；58℃，10 s；72℃，10 s。扩增完毕后进行熔解曲线分析：95℃，1 min；35℃，5 min；70℃，10 s，升温速率为0.5℃/步，每步停留20 s，并检测荧光。

1.2.4 敏感性和重复性分析 将基因型分别为0∶2、2∶0及2∶2的样本进行10倍梯度稀释，使反应体系中DNA量在0.005～50 ng之间，据此确定检测体系的敏感性。选取上述基因型样本各8例进行熔解曲线分析，每天分析1次，重复3次。计算每天各种基因型熔解曲线峰值Tm的平均值(Mean)、标准差(SD)和变异系数(CV)及各种基因型3 d全部数据的Mean、SD和CV，作为评价重复性的依据。

1.2.5 正常人样本检测 用上述检测体系对94例正常成人样本进行检测，以初步评估检测体系可靠性。

1.2.6 临床样本的检测 将收集到的238例已知基因型样本进行随机盲法编号，用本研究建立的方法检测，检测结果与MLPA结果进行对比。

2 结果

2.1 检测体系基因分型结果 该方法得到的熔解曲线可以准确区分SMN1exon7和SMN2exon7。在FAM通道(c.840位点)，SMN1exon7和SMN2exon7的熔解曲线峰分别为～60℃和～54.5℃，SMN1exon7纯合缺失患者则仅存在单一的～54.5℃熔解曲线峰；在ROX通道(c.835-45位点)，SMN1exon7和SMN2exon7的熔解曲线峰分别为～52℃和～41.5℃，SMN1exon7纯合缺失患者则仅存在单一的～41.5℃熔解曲线峰，见图1。

A、B、C：分别是SMN1∶SMN2为2∶2、2∶0和0∶2的样本梯度稀释检测结果，其中实线表示FAM通道信号，虚线表示ROX通道信号，不同颜色表示不同DNA量。D：94例正常成人样本检测结果，蓝色表示FAM通道，桔黄色表示ROX通道，带×曲线表示SMN1纯合缺失对照样本，带▲曲线表示其中3例SMN2纯合缺失样本。E：已知基因型样本的部分代表性峰型，其中1例为c.840和c.835-45位点结果不一致样本：蓝色曲线，ROX通道用×标记。F：该样本测序图，c.840位点和c.835-45位点均为杂合状态，提示存在SMN1；其中黑色方框分别表示探针c.840P和c.835-45P结合区域，可以看出c.840P探针结合区域内存在碱基变异c.835-5T>G

图1熔解曲线图形及测序结果

2.2 灵敏度和重复性分析结果 10倍梯度稀释的0∶2、2;2及2∶0基因型样本的检测结果显示(图1-A～C)，DNA量在0.05～50 ng之间时，本研究建立的反应体系可以获得准确的熔解曲线峰，当DNA量为0.005 ng时，没有熔解曲线峰，说明反应体系的敏感性至少为0.05 ng DNA。在不同时间对上述基因型样本各8例进行检测，可以看到CV在0.05%～0.17%之间，表现出良好的重复性，见表2。

2.3 94例正常成人样本检测结果 未检测出SMN1exon7纯合缺失，有3例存在SMN2exon7 纯合缺失。

2.4 238例临床样本检测结果 经常规MLPA法和本研究建立的探针熔解曲线法检测，232份外周血标本中，两种方法分别检出SMN1 exon7纯合缺失标本38份、SMN2 exon7纯合缺失标本11份，对比分析两种方法的诊断符合率为100%；6份胎儿标本中，SMN1exon7纯合缺失标本2份，对比分析两种方法的诊断符合率为100%。238例样本中，除1例由于存在其他变异导致2个探针结果不一致外，其余样本的2个探针结果均一致。见表3，部分代表性熔解曲线图见图1。

3 讨论

SMA的发病机制是SMN1基因缺陷引起的脊髓前角运动神经元变性。绝大部分病例存在SMN1基因的exon7纯合缺失，因此，对于SMN1基因exon7纯合缺失的检测可以诊断出绝大部分SMA患者。但SMN1基因与SMN2基因高度同源，仅有几个核苷酸差异，这给SMA患者的诊断带来一定困扰。和SMN1基因序列相比，SMN2基因exon7的第6位碱基由C变为T(c.840 C>T)，这一关键改变导致其～80%的mRNA缺乏exon7，进而导致编码蛋白缺陷[14]。这一关键碱基差异为SMA的基因诊断带来便利，PCR扩增后利用各种方法对该变异进行基因分型是几乎所有SMA分子诊断方法的基础。

通道检测批次0∶2 (n=8)2∶2 (n=8)2∶0 (n=8)SMN1SMN2SMN1SMN2SMN1SMN2FAM1-54.37±0.08 (0.15)59.37±0.08 (0.13)53.91±0.09 (0.17)59.56±0.05 (0.08)-2-54.31±0.07 (0.13)59.95±0.04 (0.07)53.91±0.08 (0.15)59.57±0.03 (0.05)-3-54.23±0.07 (0.13)59.90±0.04 (0.07)53.86±0.06 (0.11)59.49±0.06 (0.10)-总计-54.30±0.09 (0.17)59.93±0.05 (0.08)53.89±0.08 (0.15)59.54±0.06 (0.10)-ROX1-41.58±0.05 (0.12)51.73±0.04 (0.08)41.44±0.04 (0.06)51.53±0.03 (0.06)-2-41.55±0.06 (0.08)51.74±0.04 (0.08)41.44±0.05 (0.10)51.55±0.05 (0.10)-3-41.49±0.06 (0.10)51.71±0.05 (0.10)41.40±0.06 (0.12)51.51±0.06 (0.12)-总计-41.55±0.06 (0.08)51.72±0.05 (0.10)41.42±0.05 (0.12)51.53±0.05 (0.10)-

表3 238例经MLPA检测的已知SMA基因型样本检测结果

注：-表示在该温度下没有熔解曲线峰，+表示在该温度下有熔解曲线峰。*其中1例为双峰，基因型实为1∶2，由于SMN1:c.835-5T>G变异，导致MLPA结果和c.840P分型错误，但c.835-45P分型结果无误

在本研究中，我们利用荧光PCR结合探针熔解曲线分析技术对c.840C>T变异进行基因分型，建立一种简单快速准确的SMA分子诊断方法。灵敏度试验显示至少0.05 ng的基因组DNA即可成功检测，几乎所有临床样本均可满足此水平。除了高度的检测灵敏性，相同基因型样本在不同时间进行重复检测得到熔解曲线图形相似，Tm值变异度较小，显示出检测体系良好的重复性。而临床样本的检测结果进一步显示了检测体系的高度准确性和可靠性：对94例正常成人(无SMA相关病史)样本进行检测，没有检测出SMN1基因exon7纯合缺失，与预期相符；238例已知基因型的临床样本的盲法分析除1例不一致以外，其余诊断结果均与MLPA方法完全符合，显示了高度的准确性。

相较于一些需要开盖操作的检测方法，如PCR-RFLP、SSCP、MLPA、DHPLC及直接测序等[10, 15-18]，荧光定量PCR的最大优点是不需要开盖操作，可以减少各种污染机会，而且自动化程度高，可以减少实验操作，适合大批样本检测，如新生儿中SMA筛查。与利用等位基因特异性引物或竞争性引物扩增的real-time PCR方法相比[19]，本研究建立的方法只需要一对引物，检测体系相对比较简单而稳定。有研究利用HRM方法对c.840 C>T进行分型[20-21]，该方法具有很高的敏感性和特异性，但HRM对仪器要求较高，且需要特殊的分析软件，难以在一般实验室使用，而我们的方法只需要普通的荧光PCR仪即可。近年有基于高通量测序诊断SMA的报道[22]，虽然能检测各种缺失及点突变，但高通量测序无论是对人员还是设备等均要求较高，而且成本较高，不适合常规采用。

在本研究的方法中，对于结果的判断依据是c.840位点的分型结果，但我们额外设计了一条探针(c.835-45P)用于检测c.840位点上游50个核苷酸位置的一个差异位点(c.835-45G>A)，作为内对照探针并验证c.840位点结果，以增加检测可靠性。虽然不排除有些SMA患者的所有SMN1基因的c.840位点碱基突变而变为SMN2情况(反之亦可)存在或缺失范围仅累计其中一个探针结合区域——这可以导致两个探针结果不一致，但此类SMA患者在所有患者中比例很少。而探针结合区域内其他核苷酸变异(非检测位点变异)可能会影响探针杂交，导致熔解曲线分型错误。在本研究检测的所有样本中，有1例样本的两个探针检测结果不一致：c.840位点为单峰，提示SMN1exon7纯合缺失，并与MLPA结果一致(提示基因型为0∶2)，但c.835-45位点为双峰，不支持前者结果；直接DNA测序显示c.840位点和c.835-45位点均为杂合状态，并不存在SMN1exon7纯合缺失，但在SMN1基因c.835-5位点存在碱基变异T>G (图1-F)——位于c.840P探针和MLPA探针的结合区域内，该变异的存在影响了探针和模板的杂交，进而导致c.840P分型和MLPA结果错误。由此可见，本研究的双探针设计可以有效降低此种风险，提高检测结果的可靠性。

另外，虽然不同基因型样本的熔解曲线峰型有区别，但其中SMN1和SMN2相对比值相同的样本(如比例为1∶1和2∶2的样本)形成的峰型类似。因此，该方法难以检测SMN1基因exon7杂合缺失，但缺失与点突变的复合杂合子在所有患者中比例很少，仅占3%左右。综上所述，本方法可以检测出绝大部分SMA患者，而且易于操作，非常适合于大批量样本检测。在SMA产前诊断中，为保证结果的可靠性，通常需要两种不同原理方法平行检测，本研究建立的方法简单可靠，可以作为常规方法的补充检测方法。