石艺婷，何英杰，3，陈芸，唐其，4*，谭海燕，刘东波，2，4，谢红旗，2，3，4*

1.湖南农业大学 园艺园林学院，湖南 长沙 410128；2.国家中医药管理局 亚健康干预技术实验室，湖南 长沙 410128；3.湖南省中兽药重点实验室，湖南 长沙 410128；4.湖南省植物功能成分利用协同创新中心，湖南 长沙 410128

枳壳为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培变种的干燥未成熟果实，是国家规定的114种可用于中药类保健食品原料之一，主要分布于四川、重庆、湖南、江西等省，其中属“湘枳壳”产量较大，为大宗中药材[1-2]。枳壳性微寒，味酸苦，归脾胃经，用于胸胁气滞、胀满疼痛、食积不化、脏器下垂等，具有调节胃肠动力、抗氧化、利胆排石及抗抑郁等多种功效[3-5]。

枳壳中有效成分主要有黄酮、三萜、多糖、多酚、少量挥发油及生物碱等[6-7]。黄酮类化合物主要为二氢黄酮，如柚皮苷、新橙皮苷等，具有抗氧化、抗炎、抗癌抑菌等作用[8-10]；三萜类成分以柠檬苦素为代表，具有抗肿瘤、保护神经等生物活性[11-12]；多糖主要由阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖构成，能有效促进小鼠脾细胞的增殖，具有一定免疫增强活性[13-15]；多酚类物质具有良好的生物活性，主要表现在抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病、抑制肥胖等方面，是近年来的研究热点之一，而目前关于枳壳多酚的报道较少[6，16-17]，但同属中药枳实中多酚具有一定的抗氧化活性，并能抑制脂肪酶和葡萄糖苷酶活力[18]。

中药类保健食品的研究开发主要包括配方、工艺和质量标准，其中质量标准研究为基础保障[19]。而关于枳壳的质量标准控制一般以《中华人民共和国药典》为准，即以柚皮苷和新橙皮苷的含量为评价指标，由于控制指标少，不能全面真实反映产品的质量。基于已有的研究，本文选择枳壳的特征性成分柚皮苷、新橙皮苷、多酚、三萜以及多糖的含量为质量指标，通过Criteria Importance Through Inter-criteria Correlation法，即CRITIC客观赋值法，建立枳壳综合质量评价体系，分析并比较了以湘枳壳为主的12个枳壳样品的品质，旨在构建一种客观的评价体系来反映枳壳的药材质量，为今后枳壳在中药保健品等领域的质量标准研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

DHG-9246A烘箱(上海精宏实验设备有限公司)；YS-20粉碎机(北京燕山正德机械设备有限公司)；XS205分析天平(德国METTLER TOLEDO公司)；KM5200DV超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；2-16R高速离心机(恒诺仪器公司)；UV-1800紫外分光光度计(日本岛津公司)；1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)。

1.2 试药

柚皮苷对照品(Naringin，上海源叶生物有限公司，批号：B12594)、柠檬苦素对照品(Limonin，上海源叶生物有限公司，批号：B20911)、新橙皮苷对照品(Neohesperidin，上海源叶生物有限公司，批号：B21390)；一水合没食子酸、葡萄糖(天津科密欧化学试剂有限公司)；甲醇、乙醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸、碳酸钠、福林酚、三氯化铝、蒽酮、硫酸(上海国药集团试剂有限公司，分析纯)。

枳壳样品经湖南中医药大学药用植物学专业王智老师鉴定为正品，具体信息见表1。

表1 枳壳样品信息

2 方法

2.1 样品处理

将枳壳干样置60 ℃烘箱中，烘干24 h，然后取适量药材置植物粉碎机中粉碎，再过80目筛，即得。

2.2 柚皮苷、新橙皮苷含量测定

2.2.1 色谱条件 参考《中华人民共和国药典》(2015版)及相关研究[3，20]中的方法稍作改进。采用Agilent-ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)为流动相，梯度洗脱程序：0～5 min，10%～15%B；5～10 min，15%～18%B；10～15 min，18%～20%B；15～20 min，20%～22%B；20～25 min，22%B；25～30 min，22%～25%B；检测波长为284 nm；色谱柱温度为30 ℃；流动相流速为0.7 mL·min-1；进样体积为10 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品柚皮苷0.44 mg、新橙皮苷0.40 mg，用甲醇溶解并定容到1.0 mL，制成混合对照品储备液，分别取储备液稀释到质量浓度为0.43～225 μg·mL-1，过0.45 μm滤膜后进行色谱分析，并以相应对照品溶液浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标绘制标准曲线(Y)。

2.2.3 供试品溶液的制备 称取干燥的枳壳粉末(AF-1～AF-12)50.00 mg置于锥形瓶中，按料液比1∶100，分别加入50.0 mL甲醇，密封后称质量，超声提取30 min后再称质量，再用甲醇补足质量，抽滤，取滤液于4 ℃贮存，备用。

2.2.4 柚皮苷、新橙皮苷含量测定 取2.2.3制备的供试品溶液过0.45 μm滤膜后，按照2.2.1项色谱条件进行定量分析。

2.3 多酚含量测定

2.3.1 枳壳样品处理 按2.2.3的方法操作。

2.3.2 没食子酸标准曲线 采用福林酚显色法，参考文献[21-22]方法。称取一水合没食子酸对照品110.00 mg，用蒸馏水配成质量浓度为1.0 mg·mL-1的没食子酸对照品溶液；分别移取适量溶液配制成10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg·mL-1的对照品溶液。分别移取各浓度的对照品溶液0.5 mL于试管中，依次加入蒸馏水2.5 mL、福林酚试剂0.5 mL和7.5%碳酸钠溶液1.5 mL，室温下显色2 h，以没食子酸对照品溶液为参比溶液，用紫外分光光度计于760 nm波长下测定吸光度，以没食子酸浓度为横坐标、吸光度为纵坐标制作标准曲线。

2.3.3 多酚含量测定 取各样品溶液10.0 μL，加甲醇至0.5 mL，并用甲醇溶液作参比溶液，按照2.3.2的方法进行测定。

2.4 三萜含量测定

2.4.1 供试品溶液制备 按照2.2.3方法，制备供试品溶液后将其稀释3倍，备用。

2.4.2 柠檬苦素标准曲线 参考文献[23-24]的方法，精密称量柠檬苦素对照品1.20 mg，用甲醇定容至5.0 mL。分别移取0.10、0.20、0.40、0.60、0.70 mL柠檬苦素溶液于试管中，用甲醇补足到1.00 mL，依次加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.40 mL、高氯酸1.0 mL，摇匀，60 ℃水浴加热15 min后冰水浴冷却，再加入5.00 mL冰醋酸，室温静置15 min后于548 nm波长处测定吸光度，并制作标准曲线。

2.4.3 三萜含量测定 取各样品溶液0.10 mL，加甲醇至1.00 mL，以甲醇溶液为参比，按照2.4.2的方法进行测定。

2.5 多糖含量测定

2.5.1 供试品溶液制备 称取各枳壳样品1.00 g分别加入20.0 mL甲醇，超声脱脂30 min后抽滤，继续加入20.0 mL甲醇溶液，重复上述操作，得滤渣，置通风橱中吹干，再往滤渣中加入30.0 mL蒸馏水，沸水加热提取30 min，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至一定体积，加入适量乙醇，4 ℃过夜保存后高速离心10 min，弃上清液，得多糖沉淀，加蒸馏水溶解后定容至50.0 mL。

2.5.2 葡萄糖标准曲线 采用蒽酮-硫酸法[15，25]，精密称取干燥的葡萄糖对照品10.00 mg，加蒸馏水定容得质量浓度为0.10 mg·mL-1葡萄糖对照品溶液。分别精密量取0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL上述溶液于试管中，用蒸馏水补足到2.0 mL，再往各试管加入0.1%蒽酮-硫酸溶液6.0 mL，迅速摇匀，室温反应15 min后冰水浴15 min；以2.0 mL蒸馏水作参比溶液，于625 nm处测定吸光度。以葡萄糖溶液浓度为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。

2.5.3 多糖含量测定 依照2.5.2的方法并计算出多糖含量。

2.6 数据处理

对所得数据通过Excel 2010软件进行处理。

3 结果与分析

3.1 枳壳有效成分含量测定

3.1.1 线性回归方程 按实验方法操作，以对照品溶液质量浓度为横坐标(X)，各对照品溶液的峰面积或吸光度A为纵坐标(Y)，得到柚皮苷、新橙皮苷、没食子酸、柠檬苦素、葡萄糖对照品的线性回归方程，见表2。结果表明，各对照品的质量浓度与吸光度的线性关系良好。

表2 各对照品线性回归方程及相关系数

3.1.2 含量测定结果 通过高效液相色谱法和紫外分光光度法，测定不同产地枳壳有效组分的含量，将各样品3次测定结果的平均值列于表3。由表3可知，以《中国人民共和国药典》(2015版)为指导，即枳壳中柚皮苷含量不能低于4.0%，各样品均符合要求；新橙皮苷含量不能低于3.0%，除AF-1、AF-4和AF-10外其余样品均符合要求。

表3 枳壳5个指标测定结果(n=3) mg·g-1

3.2 CRITIC赋值法分析

3.2.1 CRITIC法原理 CRITIC法是一种与主观权重赋值法相比更为科学可靠的客观赋值法。它是通过各指标间的对比强度和冲突性来综合衡量其客观权重[26-28]。对比强度表示同一指标各个类别之间取值差距的大小，以标准差的形式表现出来，用σj表示，即σj越大则同一指标内各类别之间的差距越大。各指标间的冲突性以指标之间的相关性为基础，通常用Rj表示，如果指标之间具有较强的正相关，说明这两个指标的冲突性较低，则表明这两个指标反映的信息较为相似。

设Cj为第j个指标所包含的信息量，Cj越大，则第j个指标所包含的信息量越大，该指标的相对重要性越大，客观权重Wj就越大。

(1)

Cj=σjRj

(2)

(3)

其中，rij为指标i与j之间的相关系数。

3.2.2 相关性分析 采用Excel 2010软件分析上述指标间的相关性，结果见表4。由表4可知，柚皮苷含量与其他4个指标均呈较好的相关性，其中与多糖含量的相关系数为0.550，与多酚含量的相关系数达0.698；而新橙皮苷含量仅与多酚含量有良好的相关性，为0.733；多酚含量与三萜含量之间也有较大的相关性；而多糖含量与三萜含量呈一定的负相关。

表4 各指标间的相关性

注：—表示数据已有，不再重复。

3.2.3 CRITIC法分析 本实验采用CRITIC法对枳壳中柚皮苷、新橙皮苷、多酚、三萜以及多糖含量进行权重赋值，并以此作为枳壳品质的评价指标。首先按照标准化数据=(该次试验值-试验最小值)/(试验最大值-试验最小值)，对表3的数据采用Excel 2010软件进行标准化处理，然后根据3.2.1的公式计算各指标的对比强度、冲突性、信息量和客观权重，结果见表5。

表5 评价指标的对比强度、冲突性、信息量和客观权重

由上表可知，各指标的客观权重系数分别为0.115、0.194、0.171、0.237和0.284，故将加权得分公式设定如下。

Y=(柚皮苷含量/柚皮苷最大含量)×0.115×100+(新橙皮苷含量/新橙皮苷最大含量)×0.194×100+(多酚含量/多酚最大含量)×0.171×100+(三萜含量/三萜最大含量)×0.237×100+(多糖含量/多糖最大含量)×0.284×100

(4)

根据公式计算各枳壳样品的得分和排序结果见表6。

表6 CRITIC法得分表

由上表可知，样品的得分范围为42.003～92.936。由表5可知，多糖含量的信息量、所占的客观权重均较其他指标大，因此它对加权公式的影响也最大；三萜含量的信息量和客观权重仅次于多糖，对加权得分也有较大影响。

而由表3可知，多糖含量排在前3位的样品编号依次是AF-5、AF-10、AF-11，三萜含量排在前3的分别是AF-7、AF-3、AF-5，而最终得分前3名为AF-7、AF-12、AF-5。由表3可知，AF-7各项指标含量均比较高，尤其是柚皮苷、三萜及多酚的含量均位于第一，因而最终得分最高，品质最好；AF-12虽然只有新橙皮苷含量最高，但其他指标排名都比较靠前，得分也相应较高。而AF-5有3项指标位于前3，其中属多糖含量最高，另外两项得分虽相对靠后，但其对加权公式影响较小，最终得分依然较高。排名靠后的3个样品的编号分别是AF-10、AF-1和AF-4，它们各指标含量均比较靠后，尤其是AF-4，所有指标值均在最后3名内，品质较差。

从产区来看，产自三眼塘镇的AF-5、AF-7得分高，排名靠前，较沅江其他产地品质更佳；而同产于三眼塘镇的AF-6各指标值较低，排名相对靠后，推测与栽培技术、采收时间等有关，具体原因还有待研究。在各产地中，属沅江南咀镇的样品得分最低，品质较差。

4 结论

随着中药保健食品概念的推广，人们逐渐开始意识到防治未病的重要性，功能食品的保健功效也越来越受到重视，而枳壳作为一种常用的理气药，在保健品等领域的开发尚处于起步阶段。枳壳中所含的黄酮类、多酚类、三萜以及多糖类化合物是其主要的有效活性成分，具有较强的药理作用及保健功效，通过测定这些有效成分的含量，并基于CRITIC客观赋值法建立可以客观反映不同来源枳壳质量的评价体系，为今后枳壳在功能产品的开发利用领域提供借鉴。