孔晓武　丁青　张琦

[摘要] 目的 探討AMPK抑制TGF-β信号通路减轻EMT诱导膀胱癌转移机制。 方法 采用Lipofectamine2000介导AMPKα1转染至人膀胱移行上皮癌BIU-87，噻唑蓝（MTT）比色法和AnnexinV-FITC/PI双染法检测shRNA对细胞增殖和凋亡的作用。细胞划痕实验、Transwell小室侵袭实验检测体外细胞迁移和侵袭能力。Western blot检测E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表达情况。 结果 转染后的C4-2 DN细胞生长速度明显慢于未转染的BIU-87细胞及转染空载体的C4-2 E细胞，且在24 h内的细胞凋亡率均明显高于转染空载体的C4-2 E，组间差异具有统计学意义（P<0.05）。AMPK抑制TGF-β信号通路能够抑制人膀胱移行上皮癌BIU-87细胞的增殖和侵袭迁移（P<0.05）。同时，AMPK抑制TGF-β信号通路下调N-cadherin 和 Vimentin 蛋白水平，上调E-cadherin 蛋白表达。 结论 AMPK抑制TGF-β信号通路下调N-cadherin 和 Vimentin 蛋白水平，上调E-cadherin 蛋白表达，减轻EMT诱导膀胱癌转移。

[关键词] AMPK;TGF-β信号通路;EMT;膀胱癌;转移

[中图分类号] R737.14          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）12-0028-04

Mechanism research of AMPK in inhibiting TGF-β signaling pathway and alleviating the metastasis of EMT-induced bladder cancer

KONG Xiaowu1   DING Qing2   ZHANG Qi2

1.Department of Urology， Zhejiang Provincial People's Hospital Haining Hospital， Haining Central Hospital， Haining 314408， China; 2.Department of Urology， Zhejiang Provincial People's Hospital， Hangzhou 310014， China

[Abstract] Objective To investigate the role of AMPK in inhibiting TGF-β signaling pathway and attenuating EMT-induced bladder cancer metastasis. Methods Lipofectamine2000 was used to mediate AMPKα1 transfection into human bladder transitional cell carcinoma BIU-87. The effect of shRNA on cell proliferation and apoptosis was detected by MTT colorimetric assay and AnnexinV-FITC/PI double staining. Cell scratch assay and Transwell chamber invasion assay were used to detect cell migration and invasion in vitro. The expression of E-cadherin， N-cadherin and Vimentin protein was detected by Western blot. Results The growth rate of C4-2 DN cells after transfection was significantly slower than that of untransfected BIU-87 cells and C4-2 E cells transfected with empty vector， and the apoptosis rate of C4-2 DN cells after transfection was significantly higher than that of C4-2 E cells transfected with empty vector transfection within 24 h， and the difference between groups was statistically significant （P<0.05）. AMPK inhibits proliferation and invasion and migration of human bladder transitional epithelial carcinoma BIU-87 cells by inhibiting TGF-β signaling pathway （P<0.05）. At the same time， AMPK inhibits TGF-β signaling pathway and down-regulates N-cadherin and Vimentin protein levels， and up-regulates E-cadherin protein expression. Conclusion AMPK inhibits TGF-β signaling pathway， down-regulates N-cadherin and Vimentin protein levels， up-regulates E-cadherin protein expression， and reduces EMT-induced bladder cancer metastasis.

[Key words] AMPK; TGF-β signaling; EMT; Bladder cancer; Metastasis

膀胱癌为泌尿系统常见恶性肿瘤之一，根据浸润程度不同分为肌层浸润性膀胱癌和非肌层浸润性膀胱癌两种。相关研究[1]结果显示，肌层浸润性膀胱癌远处转移程度高，病情进展快，5年存活率低于10%。因该类癌症的发生与发展过程极为复杂，涉及多种抑癌基因及通路的抑制与激活情况[2]。故研究这些基因以及其中通路因子对癌症发生、转移的影响，对癌症的治疗以及预防具有一定意义。上游蛋白激酶（AMPK）是公认的具有抑癌功能的功能性物质，因肿瘤组织微环境或基因突变所致的AMPK活性下降是肿瘤发生发展的重要机制[3]。以往研究[4]表明，AMPK通过限制细胞周期检查点或能量瓶颈，促进细胞凋亡，抑制增殖。转化生长因子 β（TGF-β）信号的过度活跃则是肿瘤细胞复发及转移的诱因，TGF-β通过诱导肿瘤细胞发生上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），促进肿瘤细胞增殖与转移[5-6]。但目前有关过度活跃的TGF-β 信号与AMPK活性下降是否有关，以及激活AMPK对TGF-β 信号转导、EMT、肿瘤转移的作用均鲜有报道。本研究通过考察AMPK对TGF-β信号及EMT 标志物的影响，探讨AMPK抑制TGF-β信号通路减轻EMT诱导膀胱癌转移机制。现报道如下。

1材料与方法

1.1 一般材料

2017年9月～2018年5月选用人膀胱移行上皮癌BIU-87，由上海市肿瘤研究所癌基因国家重点实验室提供。二甲基亚砜及四甲基偶氮唑蓝购自美国Sigma公司。LipofectamineTM转染剂购自LTI公司。培养基、胎牛血清、单克隆抗体Vimentin、N-cadherin、E-cadherin购自上海基尔顿生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养  采用含10%胎牛血清的1640培养基（含0.1%链霉素及青霉素）培养BIU-87为人膀胱移行上皮癌细胞株，在37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养，以0.25%胰蛋白酶消化传代。以不转染AMPKα1人膀胱移行上皮癌BIU-87细胞为对照组，以Lipofectamine2000介导AMPKα1转染至人膀胱移行上皮癌BIU-87细胞为实验组。

1.2.2 AMPK DN细胞株构建  将AMPKα1亚单位显性失活突变体（DN）、慢病毒包装质粒、Lipofectamine 2000 按比例均匀滴入BIU-87细胞培养液，6 h后更换不含上述物质的新鲜培养液，孵育过夜，收集培养液上清，观察细胞，上清液浓缩后储存在-80℃冰箱。此外，将以 Scramble DNA代替目的基因转染BIU-87细胞，为对照组（C4-2 E）细胞。

1.2.3 AMPK DN细胞株的筛选  转染72 h后，将1 μg/mL的Puromycin选择培养液同时加入至3组细胞中并进行筛选，每隔2 d换液1次，对AMPK DN基因慢病毒感染 C4-2细胞进行筛选，并构建稳定细胞株（C4-2 DN）。

1.2.4 细胞划痕实验  先用记号笔每隔 0.5～1.0 cm在6孔板底面划一横线进行标记，随后每孔加入约5×105个细胞，培养过夜。PBS洗去细胞碎屑后，每个孔内分别加入含血清、无血清、含药物、含 TGF-β1因子的不同培养基，低倍镜拍照，记录0 h时细胞数量，培养24 h后，再次拍照，计算迁移速率。

1.2.5 Transwell小室侵袭实验  将2×105个BIU-87细胞接种于8 μm 孔径小室，下室加入含5 ng/mL TGF-β1培养液，上室则加入 10 mM AMPK抑制剂（二甲双胍）。孵育过夜后，采用多聚甲醛溶液固定，室温风干，0.1%结晶紫溶液染色，PBS清洗晾干后，100倍显微镜下观察并计数细胞。

1.2.6 检测细胞增殖并绘制细胞生长曲线[7]  将C4-2 E细胞、C4-2 DN细胞、未转染BIU-87细胞分别以每孔2×103个细胞接种于96孔培养板，并设不加细胞仅加培养液的试验孔为空白对照孔。接种2 d后转染，并在转染24 h、48 h以及72 h弃去培养液，测定OD值。计算细胞生长率。接种2 d后每天取每种细胞6孔，通过四唑盐比色试验（MTT）法检测细胞活性。在波长为492 nm下，读取酶标仪上测定的各孔吸光度（OD）值，最终结果为6孔平均值，并以时间为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

1.2.7 检测细胞凋亡  分别于24 h、48 h、72 h 3个时相点收集C4-2 DN细胞及对照组细胞，制成浓度为 5×106/mL的细胞悬液，加1×105个细胞至流式管内，PBS洗涤3次，离心取沉淀，加入5 μL的 AnnexinV-FITC和PI，避光室温放置5 min。60 min内采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。PI通过FL2通道检测红色荧光，AnnexinV-FITC 通过FL1通道检测绿色荧光。若AnnexinV-FITC与PI均为阳性，则为坏死细胞或晚期凋亡细胞，若AnnexinV-FITC阳性，PI阴性则为早期凋亡细胞，反之为正常细胞。

1.2.8 实时定量 PCR检测基因转录水平的表达变化  细胞经处理后用 Trizol 法提取总 RNA，定量后按照反转录试剂盒说明书合成 cDNA。随后通过实时定量 PCR 进行扩增，并利用BioRad CFX Manager软件进行定量分析。

其中引物序列如下：E-cadherin 正义5'-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3'，反义5'-GGGTGTCGAG-GGAAAAATAGG-3';N-cadherin正义5'-TCAG-GCGTCTGTAGAGGCTT-3'，反义5'-ATGCACATCCTTCGATAAGACTG-3';Vi-mentin正义5'-GACGCCATCAACACCGAGTT-3'，反义5'-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3';β-actin正義5'-CATGTACGT-TGCTATCCAGGC-3'，反义5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。

1.2.9 Western blot检测E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表达情况[8]  将细胞中的组织蛋白采用蛋白裂解液法进行提取，并通过Western blot法检测其中的E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达情况。

1.3统计学方法

应用 SPSS19. 0 统计软件包进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组细胞的生长曲线

由封三图6、7可知，转染空载体BIU-87的细胞生长曲线与BIU-87细胞相似，而C4-2 DN细胞生长速度明显慢于未转染的BIU-87细胞及转染空载体的C4-2 E细胞。BIU-87细胞生长7 h细胞数为（600.35±121.46），C4-2 DN细胞生长7 h细胞数为（325.14±102.47），C4-2 E细胞生长7 h细胞数为（598.77±119.58），三组比较，差异有统计学意义（F=4.720，P=0.002）。

2.2 不同组细胞的凋亡

C4-2 DN细胞在24 h、48 h及72 h细胞凋亡率均明显高于转染空载体的C4-2 E的细胞，且组间差异具有统计学意义（P<0.05），见封三图8、图1及表1。

2.3 AMPK抑制TGF-β诱导的细胞迁移

进行细胞划痕实验时，分别给TGF-β1、AMPK 激活剂处理，24 h时后观察结果显示，AMPK 激活剂处理的划痕间距明显宽于TGF-β1 因子刺激组。随后的transwell实验结果显示，AMPK 激活剂处理组迁移细胞数（0.23±0.02）明显少于TGF-β1 因子刺激组（0.59±0.11），组间差异具有统计学意义（t=3.256，P=0.00），见封三图9、10。

2.4 AMPK对膀胱癌细胞EMT的影响

实时定量PCR显示，AMPK 激活剂处理后细胞内E-cadherin 的 mRNA水平上调，N-Cadherin和Vimentin的mRNA水平下调（P<0.05，表2）。此外，通过Western blot发现AMPK 激活剂处理后细胞内的N-Cadherin和Vimentin蛋白水平明显下调，E-cadherin蛋白表达上调，见图2。

3讨论

本研究主要比较不同转染组及未转染组之间的细胞生长规律，结果显示，转染空载体BIU-87的细胞生长曲线与BIU-87细胞相似，而C4-2 DN细胞生长速度明显慢于未转染的BIU-87细胞及转染空载体的C4-2 E细胞，且C4-2 DN细胞在24 h细胞凋亡率均明显高于C4-2 E细胞，提示转染AMPK能够抑制BIU-87细胞的生长;对比转染AMPK的C4-2 DN细胞与仅转染空载体的C4-2 E细胞两者生长情况后发现，转染AMPK的C4-2 DN细胞生长速率明显低于仅转染空载体的C4-2 E细胞，在24 h凋亡率均明显高于转染空载体C4-2 E细胞，进一步验证了抑制BIU-87细胞生长的因素是AMPK，而不是载体Lipofectamine2000。分析AMPK抑制膀胱癌细胞生长的机制，可能与以下机制有关：（1）AMPK 具有抑制TSC2-mTOR蛋白合成，间接地抑制肿瘤细胞生长与增殖的功能[9-10];（2）AMPK 通过调节 p53-p21表达，从而平衡细胞的增殖与凋亡，调控细胞周期[11];（3）AMPK通过上调p53蛋白水平，阻断细胞周期，促进肿瘤细胞凋亡[12-13];（4）AMPK能够抑制TGF-β诱导的Smad2/3磷酸化，阻断Smad2/3核定位[14]，从而阻碍肿瘤细胞的转录反应，发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用。

为进一步探讨AMPK与TGF-β 信号通路间的关系，本研究分别给TGF-β1、AMPK 激活剂处理BIU-87细胞进行细胞划痕试验，结果显示，AMPK激活剂处理的划痕间距明显宽于TGF-β1因子刺激组，提示AMPK对于细胞迁移的抑制作用与TGF-β信号通路有关。而Transwell实验结果也证实了这一点，AMPK激活剂处理组迁移细胞数明显少于TGF-β1因子刺激组（P<0.05）。经Lin H等[14]研究证实，AMPK 可通过抑制 Smad2/3 靶标转录，从而降低TGF-β促转移作用。

EMT是由上皮细胞变为间质细胞的过程，参与肿瘤细胞远处迁移和局部浸润。既往研究[15-17]表明，肿瘤细胞通过 EMT获取间质细胞的侵袭性，从而浸润至相邻组织，最终形成肿瘤细胞的远端转移。此外，EMT过程中MMPs、N-cadherin、纤维连接蛋白（Fi-bronectin）、波形蛋白（Vimentin）等间质细胞因子表达增加，E-钙黏着蛋白（E-cadherin）的合成受到抑制，细胞极性降低，紧密连接破坏，间质特征增强[18]。本次研究结果发现，AMPK激活剂处理后细胞内的N-cadherin和Vimentin蛋白水平明显下调，E-cadherin蛋白表达上调，提示AMPK具有抑制EMT进程的能力。由于TGF-β/Smad信号通路是诱导EMT的关键通路[19]，AMPK能够阻断TGF-β/Smad信号通路，因此也能够抑制EMT进程，从而影响上皮细胞特征标志物（N-cadherin、Vimentin、E-cadherin等）的表达。Bays JL等[20]发现，增强AMPK的活性，能够明显降低N-Cadherin和Vimentin蛋白水平，抑制肿瘤细胞的侵袭能力，降低肿瘤细胞的恶性程度。

综上所述，AMPK活性大小与膀胱癌的发生、发展关系密切，其在人體内的表达缺失、突变或许是膀胱癌早期癌变的预兆，AMPK通过抑制TGF-β信号通路减轻EMT诱导膀胱癌转移，有望成为膀胱癌未来诊断以及治疗的潜在靶标，为疾病的治疗提供新思路。

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