冯 杰,乔建顶,张美玲,赵 月,王新卫

(1.河南农业大学牧医工程学院禽病研究所,河南 郑州 450002;2.洛阳市乔哥农业开发有限公司,河南 洛阳 471000)

笔者在临床中遇到一例绿翅金刚鹦鹉感染ABV的疑似病例,经过临床流行病学、剖检变化和RT-PCR检测ABV核酸,证实该鹦鹉感染禽波纳病毒(ABV)。报告如下。

1 病例基本信息

2018年3月23日,洛阳一鹦鹉养殖户带一死亡绿翅金刚鹦鹉到河南农业大学禽病研究所就诊。该户养鹦鹉15种,共158只,均未防疫任何疫苗。主诉：发病鹦鹉多为绿翅金刚、蓝黄金刚大型鹦鹉,而其他品种鹦鹉未出现异常。病死鹦鹉其病初呕吐不止,食欲下降,消化不良,拉原粮或墨绿色粪(见中插彩版图1),有时便血,或伴有摇头、撞头等神经症状。随病程发展,鹦鹉体质渐变弱,精神沉郁,最后衰竭而亡。饲养者曾经治疗发病鹦鹉,使用方案为抗病毒输液、补充生理盐水等,但无明显效果。

2 临床剖检

病理剖检显示,病死鹦鹉机体消瘦明显,龙骨外露,胸部肌肉深陷(见中插彩版图2);腺胃扩张明显(见中插彩版图3),膨大至原来的5～10倍,甚至占据整个腹腔;胃壁薄,腺胃乳头消失(见中插彩版图4),内有未消化食物;胰脏有白色坏死灶,心包少量积液,见脑淤血。未见其他变化。结合临床症状和剖检变化,初步疑为腺胃扩张性疾病(PDD),后进一步进行实验室诊断。

3 实验室诊断

3.1 RNA的提取 无菌采集病死鹦鹉脑,腺胃,肝脏,肾脏,肺脏等多个部位的器官,将各个部位器官混合制成样品悬液,反复冻融3次,离心取上清。抽取上清加入 TRIZol组织裂解液缓慢混匀后静止5 min,再加入氯仿沉淀15 min后10 000 r/min离心15 min取上清,加入等体积的异丙醇缓慢混匀静止30 min,10 000 r/min离心15 min弃上清,加入75%乙醇沉淀5 min后风干,干燥后溶于30 μL DEPC水(1∶1 000稀释)中备用。紧接着采用二步转录法将RNA转录成cDNA,方便下一步使用。

3.2 反转录 在EP管中依照表1配制模板RNA引物混合液,后在70℃保温10 min后在冰上急冷2 min以上。后依照表2在原EP管中配置反转录反应液。然后以30℃预热10 min,42℃保温1 h,75℃反应15 min后低温冷却,得到的cDNA溶液用于PCR扩增。

表1 模板RNA引物混合液

表2 反转录反应液

3.3 PCR鉴定 根据文献[1]设计合成禽波纳病毒N 基因引物,F：5′-GGCAAGGTAATYGTCCCTGGATGGC-3′;R： 5′-CCAACACCAATGTTCCGA AGCCGAT-3′。预计扩增片段长度为221 bp。然后以Mix复合反应酶12.5 μL,双蒸水8.5 μL,上下游引物各0.5 μL,cDNA 模板 3 μL,配制成 25 μL 的反应体系,经PCR扩增后进行DNA凝胶电泳分析。经电泳跑胶后可知在221 bp左右出现明显的目的条带(图5),与目的条带位置相符。将PCR扩增产物用胶回收试剂盒全部回收,克隆入pMD18-T质粒载体上,转化到感受态大肠杆菌DH5α内,涂布到氨苄抗性平板过夜,挑取阳性单菌落,小剂量提取重组质粒,鉴定的阳性质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,测序结果的Blast分析显示,该基因在进化上处于鹦鹉波纳病毒4型毒株分支,其基因序列与鹦鹉波纳病毒4型(NCBI登录号：KU748823.1)N基因同源性为96%,因此确定送检的金刚鹦鹉感染了鹦鹉波纳病毒4型。

图5 ABV-N基因PCR扩增结果

4 讨论

禽波纳病毒(Avian Borna Virus,ABV)是一种高度精神嗜性的单股负链RNA病毒,是导致鸟类腺胃扩张性疾病(Proventricular Dilatation Disease.PDD)的主要病原体[2]。该病于20世纪70年代在金刚鹦鹉身上发生,被认为是鹦鹉种群中严重甚至是致命的神经退行性疾病[2-4]。目前,因广泛的商贸往来,PDD在全球范围内广泛传播,受感染的鸟类除了鹦鹉之外,加拿大鹅、鸵鸟、番鸭、鸽、鹩哥、密雀、织雀、金丝雀及其他雀形目鸟类等50多种鸟类中也有检出ABV的报道[5-7]。当前流行病学和试验数据表明,禽波纳病毒是一种高度精神嗜性的单股负链RNA病毒,是鹦鹉科鸟类的腺胃扩张症(PDD)的致病因子[8-9],此病毒具有广泛的组织嗜性,主要影响上消化道和中消化道的自主神经,包括食道,前胃,脑室和十二指肠[10]。腺胃影响最为明显,不能进行正常的蠕动消化,从而导致食物积压,腺胃膨大,粪便中未消化食物的存在。此外,病毒还侵入脑部神经,引起一定的中枢神经症状,如撞头,共济失调等。笔者此次病例的临床表现与此相符,内脏器官的病理变化暗示送诊鹦鹉感染了ABV,基因测序证实此病例鹦鹉感染的为ABV-4型,属于目前全球流行报道较多的为2型、3型和4型中之一种。临床问诊鹦鹉饲养主,知发病鹦鹉在我国多地有巡回演出,其感染发病时间不十分清楚。但该场内的其他类鹦鹉不曾出现该病,这是不是预示大型鹦鹉对ABV更为敏感,仍需流行病学证据。

目前,自然发病的PDD在全球多个地区都有报道,但是中国内陆还未有自然感染的病例报道出现,ABV感染引起鹦鹉PDD的自然案例也无报道。笔者的临床案例首次证实ABV亦在中国内陆有传播。这种病毒在国内的传播程度、经何种方式传入国内以及会给宠物鸟类行业、甚至家禽行业带来何种影响还未可知,仍需进一步流行病学评估。