梅 力,杨春江,韦海涛,于在江,李志军,陈会玲,杨小强,高晓龙,王 林,冯小宇

(1.北京市动物疫病预防控制中心,北京 大兴 102629;2.北京纳百生物科技有限公司,北京 大兴 100176)

牛病毒性腹泻病(BVD),又称为黏膜病,是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)所引起的,以急慢性黏膜病、持续性感染和免疫抑制为主要特征的病毒性传染病。BVD的流行范围广,感染率高,我国目前己有20多个省市自治区存在该病。华中农业大学邓明亮等于2010-2013年间采集了全国8个省份的奶牛、肉牛、牦牛和水牛血清,经检测BVDV整体抗体阳性率高达58.09%,4种牛分别的抗体阳性率为89.49%,63.27%,45.38%和14.18%。翁晓刚等于2010-2013年间对北京部分牛场流行病学调查显示,牛群中抗体阳性率高达94.1%[1]。BVD没有特征性的临床症状,往往以持续性感染的形式存在,并且持续性感染牛不能建立免疫反应而终身带毒、排毒,因牛只在临床上无典型性症状,加上BVDV往往与其他病原混合感染或导致继发感染,以上表明,BVD对牛养殖业造成的隐性损失是非常巨大的,我国BVD防控形势十分严峻[2]。

胶体金技术自1971年被引入到免疫化学中,作为一种免疫标记技术而被使用。胶体金作为标记物不存在内源酶干扰及放射性同位素污染的问题,且利用不同颗粒大小的胶体金还可以做双重甚至多重标记,使定位更加精确。由于胶体金作为标记物有很多优点,因此自该技术问世以来在国内外的许多研究领域中得到了迅速的发展[3]。P80蛋白是常用的诊断蛋白,目前已有商品化的ELISA试剂盒基于该蛋白,但胶体金检测还未见报道;虽然利用病毒分离培养、免疫荧光、ELISA和PCR等方法开展牛病毒性腹泻检测的研究已有报道[4-7],但这些传统方法均需依赖专业的仪器设备及专业实验人员,且操作费时费力,无法在基层养殖场广泛开展。本研究采用重组表达的BVDV非结构蛋白P80,建立双抗原夹心胶体金检测试纸条,为基层疫情防控提供了有效的检测手段,可用于各种规模养殖单位的整体筛查和净化,极大地改善了当前BVDV的防控状况。

1 材料与方法

1.1 试验样品 试验用标准阴、阳性血清来源于中国兽医药品监察所。BVDV病毒及待测血清样本由本实验室保存。

1.2 主要仪器设备 PCR仪(Thermo公司);纯水仪(密理博公司);培养箱(上海博讯实业有限公司);紫外分光光度计(上海精密仪器仪表有限公司);凝胶成像系统(北京昊诺斯科技有限公司);天平(赛多利斯(上海)贸易有限公司);蛋白纯化仪(GE primer公司);胶体金切条机(上海韩感电子有限公司);划膜仪(Biodot公司);胶体金读数仪(自制)、超声破碎仪(昆山超声仪器有限公司)。

1.3 主要试剂及材料 质粒pMD18-T-D(D基因片段包括BVDV的4691-7488碱基)由本实验室构建、DH5α感受态细胞,购自北京天根生物科技有限公司;杆状病毒表达载体pFastBac HT-B、DH10Bac感受态细胞由本实验室保存、羊抗牛二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司);氯金酸(Sigma公司);蛋白稳定剂(上海西宝生物科技有限公司);NC膜及其他胶体金材料(上海捷宁生物工程有限公司)。

牛病毒性腹泻P80抗体检测试剂盒(货号：P00645-5,美国 IDEXX)。

其他试剂均来自国药集团化学试剂北京有限公司。

1.4 P80重组蛋白杆状病毒系统表达 参照Gen-Bank中登录的BVDV基因序列设计引物,用于克隆P80基因片段,在上、下游引物中引入了BamH I和X ho I酶切位点,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。P80基因片段以pMD18-T-D质粒为模板,用PCR方法扩增。反应条件为：94℃预变性5 min;94℃变性45 s,退火条件为55.6℃ 45 s,72℃延伸2 min,30个循环后,再72℃延伸7 min;4℃终止反应。纯化的PCR产物与表达载体pFast-Bac HT-B分别进行双酶切后,用T4 DNA连接酶4℃连接过夜,连接产物转化DH5α感受态细胞。阳性重组质粒命名为pFastBac HT-P80B。将阳性重组质粒转座DH10Bac感受态细胞,通过用KTG抗生素和蓝白斑筛选阳性克隆,提取Bacmid,转染sf9昆虫细胞,观察转染后的细胞病变并收集重组杆状病毒。

将细胞培养上清和细胞裂解液煮样后进行SDS-PAGE电泳,对重组表达蛋白进行鉴定;将蛋白样品完成SDS-PAGE后进行转膜操作,通过湿法转印至NC膜上,经5%脱脂奶粉封闭后加入一抗(BVDV阳性血清,1∶100稀释)和二抗(兔抗牛IgG HRP,1∶3 000稀释),最后加入底物显色。

1.5 P80蛋白纯化鉴定 将重组杆状病毒以MOI 0.1感染sf9昆虫细胞,4 d后5 000 r/min离心10 min收集上清。目的蛋白的纯化参照Ni-NTA纯化系统说明书进行,纯化后的蛋白用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量后分装,-80℃保存备用。

第二，要对施工设备和施工技术方案进行控制，结合高速公路桥梁施工实际要求和质量标准，完善阶段性施工设备管理流程，要强化技术人才管理和工作人员能力培养工作，充分挖掘人力管理工作的时效性价值，合理创新施工技术方法，实现设备管理和整体施工效率提升奠定基础。除此之外，也要对人员进行集中培训，按照方案有序推动设备管理和方案监督工作[7]。

1.6 P80蛋白胶体金标记 采用柠檬酸三钠还原法制备得到40 nm的胶体金颗粒溶液,调节pH值至9.0备用。取一定量的胶体金颗粒溶液,置于磁力搅拌器上,然后将纯化后的蛋白抗原P80以PBS按照1∶2 000的比例稀释后加入胶体金溶液中搅拌反应60 min,然后将PEG 20 000溶液加入混合反应液中,使PEG的最终浓度约为1%,置于冷冻离心机(4℃)上慢速(速度为11 000r/min～13 000 r/min)离心10 min后弃去上清液。将下层沉淀用PBS反复洗涤并继续离心弃去多余上清液。最后将沉淀物以PBS缓冲液重新悬浮,使最终的蛋白浓度约为50 μg/mL左右,保存于4℃备用。

1.7 BVDV双抗原夹心胶体金检测方法的建立

1.7.1 金标垫的制备 金标垫采用聚酯膜,经含有1%BSA和1%吐温-20的PBS处理后,将制备好的胶体金标记抗原按照40 μL喷涂,完毕,37℃烘干2 h备用。

1.7.2 样品垫的制备 样品垫采用聚酯纤维垫,采用自制含有表面活性剂的处理液浸泡后烘干备用。

1.7.3 检测线和质控线包被 检测限标记物为检测抗原,质控线标记物为羊抗牛二抗。分别将检测抗原和羊抗牛二抗用含有1%BSA的PBS稀释成浓度为0.9 mg/mL和1.1 mg/mL溶液,然后用Biodot划膜仪喷涂于硝酸纤维膜上,完毕,37℃度烘干1 h备用。

1.7.4 试纸条组装 试纸条的组装按照如下(图1)模式进行。其中PVC背板、吸水垫为常规材料组装好的大板用切条机切成7 mm的裸条备用。

图1 胶体金试纸条组装图

1.7.5 试纸条检测 将待测样本以PBS稀释100倍即可用于检测。检测时取200 μL稀释好的样本至反应微孔中,插入试纸条,确保金标端插入液面,计时5 min后观察结果。阴性：质控线显色,而检测限不显色;阳性：质控线显色,而检测限也显色。超过10 min观察结果无效。

(1)灵敏度检测：将标准阳性血清和标准阴性血清用 PBS 按照1∶10,1∶50,1∶100,1∶500,1∶1 000,1∶2 000,1∶4 000稀释,用本研究制备的试纸条进行检测,将胶体金试纸条能够检测出的最高稀释度作为该试纸条的灵敏度。

(2)特异性检测：口蹄疫病毒(FMDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的阴性血清和阳性血清由本实验室保存,用建立的胶体金试纸条对以上两种病毒的阴、阳性血清进行特异性交叉试验,同时设标准阴、阳性血清对照,以判定该试纸条的特异性。

(3)稳定性检测：将研制的试纸条分别置于-20℃、室温、37℃持续保存7 d。7 d后取出,检测稀释100倍的标准阳性血清和阴性血清,单个样本重复5次,以检测结果的一致性来评判该试纸条的稳定性。

1.8 与国外试剂盒的对比试验 选取80份牛血清样品,使用建立的胶体金试纸条和IDEXX牛病毒性腹泻ELISA抗体检测试剂盒同时进行检测,分别计算阴、阳性样本的符合率,对试纸条的检测效果进行评估。

2 结果与分析

2.1 P80蛋白重组表达及纯化鉴定 阳性重组质pFastBac HT-p80PCR的鉴定结果如图2,其中1、2、3为阳性重组质粒,4、5为阴性克隆;经过SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定显示,昆虫细胞系统正确重组表达了P80蛋白,其蛋白分子量为76 kDa,如图3和图4。

图2 重组质粒pFastBac HT-P80的鉴定

2.2 P80蛋白胶体金标记 使用胶体金颗粒对制备的P80蛋白进行标记,调节蛋白终浓度为50 μg/mL,标记的P80蛋白可稳定保存于4℃。

图3 重组P80蛋白SDS-PAGE电泳图

图4 重组P80蛋白的Western Blot鉴定图

2.3 胶体金检测方法的建立

2.3.1 胶体金的检测结果 胶体金试纸条对BVDV阳性血清和阴性血清的检测结果如中插彩版图5所示。其中A为试纸条的质控条线,B为阳性血清的检测结果条线,C为阴性血清的检测结果条线。

2.3.2 灵敏度 将标准阳性血清用PBS按照1∶10、1∶50、1∶100、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000稀释,用以评价胶体金试纸条的灵敏度,从表1可知,当标准阳性血清稀释至1∶500时,胶体金试纸条的检测结果为阳性,而稀释至1∶1 000时,胶体金试纸条的检测结果为阴性,表明本研究制备的胶体金试纸条的检测灵敏度为标准阳性血清稀释至 1∶500。

表1 BVDV抗体胶体金试纸条敏感性试验结果

2.3.3 特异性 使用建立的胶体金试纸条对FMDV、IBRV的阳性血清和阴性血清进行检测,检测结果均为阴性,如表2,说明本试纸条对这几种疫病抗体无交叉反应,可以特异地识别BVDV抗体。

表2 BVDV抗体胶体金试纸条特异性试验结果

2.3.4 稳定性 将不同温度储存的试纸条分别用标准阳性血清和标准阴性血清进行检测,如表3。检测结果表明,低温冻存对试纸条的检测结果影响较大,而室温和37℃对试纸条检测结果无影响,说明试纸条具有较好的稳定性。2.4 与国外试剂盒检测结果对比 使用IDEXX P80抗体检测试剂盒和建立的胶体金试纸条对80头份牛血清样本进行重复检测,从结果中可看出,使用胶体金试纸条检测出阳性样品26份,阳性检出率为32.5%,检测出阴性样品54份,阴性检出率为67.5%。而用IDEXX P80抗体检测试剂盒检测出阳性样品30份,阳性检出率为37.5%,检测出阴性样品为50份,阴性检出率为62.5%。其中两种方法检测共为阳性的样品为26份,共为阴性的样品为50份,即阳性符合率为86.7%,阴性符合率为100%,总符合率为95%,可见制备的胶体金试纸条与商品化的ELISA试剂盒具有着较高的符合率,符合率结果见表4。

表3 BVDV抗体胶体金试纸条稳定性试验结果

表4 BVDV抗体胶体金试纸条与IDEXX抗体检测_____________试剂盒符合率的比较

3 讨论

牛病毒性腹泻病毒具有较高的排毒量,这就为使用胶体金检测该病毒提供了可能,另外,随着养牛业的集约化发展,奶牛和肉牛异地运输检疫成为了迫切需要解决的问题之一,临床上急需一种快速、灵敏、简便的牛病毒性腹泻检测技术,因此,伴随着胶体金技术的日益成熟,该方法有望成为最适合现场检测BVD病毒或抗体的方法,为BVDV的防治提供了有效工具。

童钦等学者在报道中指明[3],现行的检测BVDV的方法虽然比较多,但它们具有共同的缺点,一是对操作人员有一定的技术要求;二是需要专门的试剂和仪器[3]。这就限制了这些方法在基层的应用,而免疫胶体金试纸条检测方法在病毒诊断方面具有灵敏度高、速度快、适合现场操作等诸多优点,通过研究运用免疫胶体金试纸条法检测BVDV,将可以有效解决BVDV的现场检测问题。

目前对我国养牛业而言,BVDV的重要性及其潜在风险已经不言而喻。尤其是经过多番风险考验的奶牛养殖业正在面临国内外的多重夹击,对牛群的管理净化和系统防控需要降低成本并提高效益。本试验表明,制备的胶体金检测试纸条与商品化的ELISA检测试剂盒在灵敏度上无显著差异,且检测时间更短,操作更方便,因此可以有效地应用于对BVDV感染牛的检测,结合分群管理、净化淘汰等措施,有望做到对本病的净化,从而提高整体效益。