二维液相色谱法同时测定饲料中维生素A、维生素D3、维生素E

2019-06-19赵玉富咸伟玥

饲料博览 2019年4期

赵玉富，咸伟玥

（黑龙江省质量监督检测研究院，哈尔滨 150050）

维生素A又称视黄醇，在动物体内不但起到维持正常视觉作用，还能参与性激素的形成和保护上皮细胞。维生素D3又称胆钙化醇，是一类与动物体内钙、磷代谢相关的活性物质，能促进动物消化道对钙、磷的吸收。维生素E是一类具有生物活性的酚类物质，在动物体内能起到调节细胞核的代谢功能，促进性腺发育和提高生殖能力。维生素A、维生素D3和维生素E都是脂溶性维生素，传统饲料维生素A、维生素D3和维生素E的检测分为三个标准，过程繁琐[1-3]。食品安全国家标准食品中维生素A和维生素E可以同时检测[4]。传统检验方法的检验效率很低并且过程试剂消耗量大。

二维液相色谱采用色谱柱串联技术使得样品待测组分在一维色谱柱中得到分离，并通过阀切换模式使得其中一种或多种待测组分进入二维色谱柱中进一步分离，从而实现在复杂基质中排除干扰物质的在线净化分析过程[5-7]。近年二维液相色谱技术为复杂体系中维生素A、维生素D3和维生素E提供了新的思路，并且在实际应用方面针对于婴幼儿配方乳粉的多种脂溶性维生素检测中使用中心切割法代替正相分离净化维生素D3取得较好的效果，在饲料检测方面应用报道较少[8-9]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

二维液相色谱系统及其色谱工作站（1260 Infinity-2D，Agilent Technologies美国），配备双二极管阵列检测器（DAD），电子分析天平（BSA 2202S 0.01g、BT 25S 0.01 mg赛多利斯），超声波清洗器（KH-500DE，昆山禾创超声仪器有限公司），维生素A标准物质（纯度97.80%，Dr Ehrenstorfe），维生素D3标准物质（纯度99.97%，Dr Ehrenstorfe），维生素Edl-α-生育酚标准物质（纯度98.50%，Dr Ehrenstorfe），甲醇（色谱纯，Fisher Chemical），乙腈（色谱纯，Fisher Chemical），试验用水为超纯水。维生素复合预混合饲料（市售）。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件

一维条件：Agilent Technologies InfinityLab Poroshell 120 EC-C8（3.0 mm×150 mm，2.7µm），流速为0.6 mL·min-1梯度洗脱，流动相为流动相甲醇-乙腈-水，洗脱程序见表1。一维DAD检测器采用波长切换方式检测（VA：326 nm；VE：285 nm；波长切换时间点为9.00 min）。

二维条件：Agilent Technologies Zorbax Eclipse PAH（4.6 mm×250 mm，5µm），流速为1.0 mL·min-1，流动相为甲醇。二维DAD检测器检测（VD3：264 nm），柱温均为25℃，进样量为10µL，阀切换时间为7.80 min更改阀的位置端口1-＞6，8.90 min更改阀的位置端口1-＞2。捕获柱为SB-C18（4.6 mm×12.5 mm，5µm）。

表1 一维液相梯度洗脱程序

1.2.2 标准溶液配制

分别称取一定量的VA、VE、VD3标准品于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀。经校正VA贮备液浓度为500µg·mL-1，VE标准贮备液浓度为1.0 mg·mL-1，VD3贮备液浓度为100µg·mL-1。分别移取上述标准溶液工作液适量，制成混合工作液，VA工作液浓度为20.0µg·mL-1，VE标准工作液浓度为200µg·mL-1，VD3工作液浓度为4.0µg·mL-1。将维生素A、E、D3混合标准工作液稀释成标准曲线工作液。

1.2.3 样品测定

称取饲料10 g（精确至0.0001 g）于250 mL圆底烧瓶中，再加入5 g·L-1抗坏血酸-乙醇溶液100mL，500g·L-1氢氧化钾溶液20mL，温度80℃，磁力搅拌回流皂化30 min。将皂化液移至500 mL分液漏斗中，以石油醚萃取2次，100 mL·次-1，合并萃取液，萃取液以水洗涤至中性，收集石油醚层，经过无水硫酸钠脱水后转移至旋蒸瓶中。40℃旋蒸至近干，取下氮气吹干，再以甲醇溶解并转移定容至10 mL作为待测液。

2 试验结果

2.1 二维液相色谱的建立与阀切换时间的确定

VA和VE饲料中含量较高，VD3含量较低，且样品基质干扰较大，原标准方法需经过正相制备色谱的净化，将含有VD3的馏分蒸干定容后，再在反相色谱上进行分析。本研究采用二维色谱分离的中心切割法，样品在一维色谱柱实现初步分离后，将含有VD3的馏分切割至二维色谱柱中进行分离。系统连接图见图1。为确定阀的准确切换时间，实验将关闭阀切换命令使一维色谱柱直接与一维检测器连接，进标准品溶液，测定VD3的出峰时间起点和终点。由于使用捕获柱收集一维色谱柱的VD3的馏分，而捕获柱柱容量小，需要考虑在阀切换的时间段内捕获柱是否能完全将VD3收集到。

由图1可知，影响VD3是否被完全收集的因素主要是一维色谱柱对VD3的分离效果和一维泵系统的流速设计，实验中我们内径3.0 mm、填料粒径2.7µm的一维色谱柱，流速为0.6 mL·min-1，由标准品测试确定出阀切换时间为7.80 min更改阀的位置端口1→6，8.90 min更改阀的位置端口1→2。

图1 二维液相阀切换流路

2.2 方法线性范围与精密度

按照1.2.2标准曲线配制VA、VD3、VE标准曲线，并对已知浓度的维生素VA、VD3、VE混合标准溶液重复进样6次，以三者的峰面积计算方法精密度，VA、VE、VD3峰面积六次测定的RSD分别为1.0%、1.3%和0.5%，方法精密度良好，标准曲线范围、线性方程及精密度见表2，标准曲线图见图2。

表2 标准溶液线性关系与精密度

图2 维生素A、维生素D3和维生素E标准曲线

2.3 样品分析结果

按照1.2.3样品测定方法对饲料样品进行分析，样品分析谱图见图3。同时对实验样品的3种维生素做加标实验数据见表3。

3种维生素加标回收率为90%～98%。结果表明，该方法准确度较高。

图3 样品中维生素A、维生素E、维生素D3谱图

表3 饲料样品测试结果与加标实验结果

3 讨论

采用与国标检验方法相同的样品前处理方式，在色谱分离条件上采用二维色谱技术取代原有正相净化技术，在检验时间上本方法实现了VA、VE、VD33种维生素同时检测，在检验时间上相对于传统检测的正相净化后检测减少了三分之二，3种维生素检测只需要15 min，并且在实际消耗方面取消了正相净化的消耗，对于检测机构和生产企业在仪器和人员投入大幅降低，新方法更加符合绿色化学和现代分析技术的发展趋势。