柴 华，宋 扬，李 贽，藏玉婷，刘鑫莹，李应鹤，武 啸

（哈药集团生物疫苗有限公司研发中心，哈尔滨 150069）

1 试验材料

1.1 疫苗

鸡新城疫、禽流感（H9亚型）、禽腺病毒（Ⅰ群，4型）三联灭活疫苗（La Sota株+TJ株+HY株）：批号：201501，由哈药集团生物疫苗有限公司制备。

1.2 检验用强毒

鸡新城疫病毒北京强毒株（CVCC AV1611株），批号NDV-AV1611-QD（E1，病毒含量：107.63ELD50/0.1 mL）；H9亚型禽流感病毒TJ株，批号：AIV（H9）-TJ-QD-01（E1，病毒含量：108.63EID50/0.1 mL）；Ⅰ群4型禽腺病毒HY株，批号：FAV-HY-QD-01（F2，病毒含量：107.26TCID50/0.1 mL），均由哈药集团生物疫苗有限公司制备、鉴定、保管和供应。

1.3 血凝抑制试验抗原

鸡新城疫病毒血凝抑制试验抗原：抗原批号：NDV-La Sota-K-06，HA效价1∶1024，规格：2.0 mL·瓶-1，由哈药集团生物疫苗有限公司制备。

H9亚型禽流感病毒血凝抑制试验抗原，抗原批号：AIV（H9）-TJ-K-01，HA效价1∶512，规格：2.0 mL·瓶-1，由哈药集团生物疫苗有限公司制备。

Ⅰ群4型禽腺病毒琼脂扩散试验抗原，抗原批号：FAV-HY-K-01，琼扩效价1∶2，规格：2.0 mL·瓶-1，由哈药集团生物疫苗有限公司制备。

1.4 SPF鸡

SPF鸡由哈药集团生物疫苗有限公司五常SPF鸡场提供。

1.5 注射器

注射器购自上海达美医用塑料厂。

2 试验方法

2.1 新城疫病毒抗体效价与攻毒保护关系试验

将30日龄SPF鸡60只，随机分成6组，每组10只，1～5组分别颈部皮下免疫三联灭活疫苗10、20、50、150µL·只-1和0.5 mL·只-1，6组不免疫作为攻毒对照。各组免疫后21 d，分别采血，分离血清，测定新城疫病毒HI效价。根据效价重新分组，连同对照组各肌肉注射新城疫强毒AV1611株病毒液，0.1 mL·只-（1含105.0ELD50），观察14 d，记录试验鸡的死亡情况，计算攻毒保护率。

2.2 禽流感病毒（H9亚型）抗体效价与攻毒保护关系试验

将21日龄SPF鸡60只，随机分成6组，每组10只，1～5组分别颈部皮下免疫三联灭活疫苗0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mL·只-1；6组不免疫作为攻毒对照。各组免疫后21日，分别采血，分离血清，测定禽流感病毒（H9亚型）HI效价。根据效价重新分组，连同对照组各静脉注射H9亚型禽流感病毒TJ株0.1 mL（含107.0EID50），攻毒后第5日，采集每只鸡的泄殖腔拭子进行病毒分离。将每只鸡的样品经尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚。孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液血凝价，计算攻毒保护率。

2.3 Ⅰ群4型禽腺病毒抗体效价与攻毒保护关系试验

将21日龄SPF鸡40只，随机分成4组，每组10只，1～3组分别颈部皮下免疫三联灭活疫苗0.2、0.5和1.0 mL·只-1；4组不免疫作为攻毒对照。各组免疫后21日，分别采血，分离血清，测定Ⅰ群4型禽腺病毒琼扩抗体效价。根据效价重新分组，连同对照组各肌肉注射Ⅰ群4型禽腺病毒HY株病毒液，每只0.1 mL（含106.0TCID50）。连续观察10日，记录结果，计算攻毒保护率。

3 试验结果

3.1 新城疫病毒抗体效价与攻毒保护关系试验

新城疫病毒抗体效价与攻毒保护关系试验结果见表1。

由表1可知，新城疫病毒HI抗体效价与攻毒保护率呈正相关：HI≤2log2，攻毒保护率为0；HI=3log2，攻毒保护率为57.1%；HI≥4log2，攻毒保护率为100%。

3.2 禽流感病毒（H9亚型）抗体效价与攻毒保护关系试验

禽流感病毒（H9亚型）抗体效价与攻毒保护关系试验结果见表2。

由表2可知，禽流感病毒（H9亚型）HI抗体效价与攻毒保护率呈正相关：HI≤3log2，攻毒保护率为0；HI=4log2，攻毒保护率为83.3%；HI=5log2，攻毒保护率为88.9%；HI≥6log2，攻毒保护率为100%。

3.3 Ⅰ群4型禽腺病毒抗体效价与攻毒保护关系试验

Ⅰ群4型禽腺病毒抗体效价与攻毒保护关系试验结果见表3。

由表3可知，Ⅰ群4型禽腺病毒抗体效价与攻毒保护率呈正相关：当抗体琼扩效价为1∶1时，攻毒保护率为90%；当抗体琼扩效价为1∶2时，攻毒保护率为100%；当抗体琼扩效价为1∶4时，攻毒保护率为100%。

表1 新城疫病毒抗体效价与攻毒保护关系试验结果

表2 禽流感病毒（H9亚型）抗体效价与攻毒保护关系试验结果

表3 I群4型禽腺病毒抗体效价与攻毒保护关系试验结果

4 结论

鸡新城疫、禽流感（H9亚型）、禽腺病毒（Ⅰ群，4型）三联灭活疫苗（La Sota株+TJ株+HY株）各组抗体效价与攻毒保护均呈正相关，疫苗各组抗体效价可代替动物效检试验。根据本试验结果及我国兽药标准，将三联灭活疫苗血清标准确定为：30日龄鸡皮下注射疫苗20µL（1/25羽份），21日后测定新城疫病毒HI抗体效价的几何平均值应≥1∶16；21日龄鸡皮下注射疫苗0.5 mL，21日后测定禽流感（H9亚型）病毒HI抗体效价的几何平均值应≥1∶128；Ⅰ群4型禽腺病毒抗体效价≥1∶1[1-4]。