任 明，刘建民，孙 荣，滕安娜

（1.山东惠仕莱生物科技有限公司，山东 济南 250101；2.泰山职业技术学院 生物技术工程系，山东 泰安 271000）

橙皮苷是枳实中重要的活性成分之一，属于黄酮类化合物，其纯品为白色针状晶体，能溶于稀碱和吡啶溶液，常温下难溶于水，微溶于甲醇、乙醇、冰醋酸，无臭、无味[1]。橙皮苷具有降低血管脆性、降血压、抗过敏、抑制肿瘤、抗氧化和清除自由基等作用，临床用于心血管系统疾病的辅助治疗，还作为天然抗氧化剂用于食品和化妆品行业[2-3]。

橙皮苷的提取方法众多，包括碱提酸沉法、乙醇或甲醇提取法、超声波辅助提取法、层板法、热水提取法等，其中碱提酸沉法和热水提取法操作简单、提取率较高，是目前工业化生产橙皮苷的主要方法[4]。但该方法也存在料水比大、污染严重、环保成本高等缺点。

本文首次将复合酶提取法应用于枳实中橙皮苷的提取研究，利用纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、果胶酶等降解枳实细胞壁及间质成分，打开细胞结构对橙皮苷的包裹，促进有效成分的溶出，提高产品收率[5]。并通过正交试验对复合酶酶解条件进行优化，为枳实中橙皮苷的工业化生产提供新思路。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-20AT高效液相色谱系统（SPD-20A紫外检测器，CTO-20A柱温箱，7725i手动进样器，LCsolution色谱工作站管理软件，超声波脱气装置等，日本岛津公司）；水浴恒温振荡器（天津赛得利斯）；PHS-3C型酸度计（上海雷磁）；分析天平（北京赛多利斯）。

1.2 药品与试剂

橙皮苷对照品（Sigma公司）；川枳实（橙皮苷含量为25.2 %，成都金堂）；生物复合酶为本公司复配制成，包括：40 %酸性纤维素酶（40万U/g，山东隆科特），40 %木聚糖酶（29万U/g，山东隆科特），10 %果胶酶（5万U/g，河南圣斯德），10 %β-葡聚糖酶（3万U/g，南宁东恒华道），最适pH为4.8；水为重蒸水；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 橙皮苷检测

色谱柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-2.5 %乙酸水溶液（40:60）；流速：1 ml/min；柱温：30 ℃；波长：283 nm。该色谱条件下理论塔板数以橙皮苷峰计算不低于2000[6]。

2.2 橙皮苷提取

将枳实粉碎后过60目筛，取一定量的枳实加水后用盐酸调pH 4.8，加入生物复合酶，水浴恒温振荡，酶解完毕后调pH 12，静置10 min，定容过滤，取滤液待测[7]。

2.3 橙皮苷收率计算

取滤液1 ml，加50倍体积甲醇，用盐酸调pH 7.0，用甲醇定容至100 ml，0.45 μm滤膜过滤，经HPLC检测获得橙皮苷峰面积，按标准曲线计算提取液中橙皮苷含量，进而计算橙皮苷的收率。橙皮苷收率按以下公式计算。

橙皮苷收率（%）=提取得到的橙皮苷质量（g）×100 %／枳实质量（g）。

2.4 酶处理条件初步筛选

采用单因素试验，初步确定最适加酶量、料水比、酶解时间、酶解温度。

2.4.1 加酶量 称取枳实10 g，加入100 ml水，调pH 4.8，分别添加占底物0.1 %，0.5 %，1 %，2 %，5 %的复合酶，同时设置不加酶对照，40 ℃水浴恒温振荡6 h。取样经HPLC检测橙皮苷含量，计算收率，确定最适加酶量。

2.4.2 料水比 称取枳实10 g，分别加水30，50，80，100，200 ml，调pH 4.8，按最适加酶量添加复合酶，40 ℃水浴恒温振荡6 h。取样经HPLC检测橙皮苷含量，计算收率。确定最适料水比，即酶解底物浓度。

2.4.3 酶解时间 称取枳实10 g，按最适料水比加水，调pH 4.8，按最适加酶量添加复合酶，40 ℃水浴恒温振荡，酶解时间分别为1，2，4，6，8，10 h。取样经HPLC检测橙皮苷含量，计算收率，确定最适酶解时间。

2.4.4 酶解温度 称取枳实10 g，按最适料水比加水，调pH 4.8，按最适加酶量添加复合酶，按最适酶解时间，分别采用20，30，40，50，60 ℃水浴恒温振荡。取样经HPLC检测橙皮苷含量，计算收率。确定最适酶解温度。

2.5 正交试验

在单因素试验的基础上，设计了4因素3水平正交试验，重点研究加酶量、料水比、酶解时间、酶解温度4个因素对橙皮苷收率的影响，确定枳实酶解的最佳工艺参数。正交试验因素水平设计见表1。

表1 正交试验因素水平设计

3 结果与分析

3.1 橙皮苷的HPLC测定结果

配置不同浓度的橙皮苷对照品溶液，按2.1项色谱条件进样测定，制作橙皮苷对照品标准曲线，以峰面积Y对浓度X（mg/L）进行线性回归， 得回归方程：Y=16 746.7X-23 652.7，r=0.9995，线性范围：10.783～80.902 mg/L。橙皮苷与其他组分分离良好，保留时间为12.753 min。对照品和供试品溶液的HPLC图谱见图1～2。

图1 橙皮苷对照品HPLC图谱

图2 橙皮苷提取液HPLC图谱

3.2 单因素试验结果

3.2.1 加酶量 结果见图3。酶添加量在0～0.5 %范围内，橙皮苷收率随酶用量的增加而增大，酶添加量为0.5 %，1 %，2 %时收率相当，当酶添加量大于2 %时，收率反而下降，可能是由于酶相对于底物已达到过饱和，继续增加酶用量则会包裹住枳实颗粒，从而阻碍橙皮苷成分的溶出。综上，从橙皮苷收率和用酶成本综合考虑，确定加酶量为0.5 %。

图3 加酶量对橙皮苷收率的影响

3.2.2 料水比 结果见图4。料水比为1:5，1:8，1:10时，橙皮苷收率相当，从减少废水排放角度考虑，确定料水比为1:8。

图4 料水比对橙皮苷收率的影响

3.2.3 酶解时间 结果见图5。酶解时间为4～6 h，收率达到最高。随着时间的延长，收率反而下降，其可能原因是橙皮苷在长时间的处理下发生了氧化。因此，从试验周期和动力消耗方面考虑，选择酶解时间为4 h。

图5 酶解时间对橙皮苷收率的影响

3.2.4 酶解温度 结果见图6。橙皮苷收率随酶解温度的升高而增大，当酶解温度达50 ℃后，随着酶解温度的进一步升高而呈下降趋势。这是因为温度过低，不利于酶活性的发挥；温度过高则会引起酶变性、失活。因此确定最适酶解温度为50 ℃。

图6 酶解温度对橙皮苷收率的影响

3.3 正交试验

在单因素试验结果的基础上，进行了4因素3水平的正交试验。结果见表2。4个因素对橙皮苷提取得率的影响大小依次为DABC，即，酶解温度＞加酶量＞料水比＞酶解时间。其中D、A 为主要影响因素。各因素最佳水平为A2B1C2D3，即加酶量为0.5 %、料水比1:5、酶解时间2 h、酶解温度50 ℃。在此条件下，经过一次提取能将枳实中99.2 %的橙皮苷提取出来。

在优化工艺条件下进行了5 次重复试验验证，最佳酶解条件下橙皮苷的平均收率为24.9 %，RSD为1.8 %。由此可得，优选后的酶解条件稳定可行，重复性好。

4 讨论

橙皮苷作为一类重要的天然黄酮类化合物，广泛应用于医学、食品、化学、生物学等多个领域[8-10]。目前，从枳实中提取橙皮苷多采用碱提酸沉法，该工艺虽有较高的收率，但存在料水比高、酸碱用量大、提取周期长等问题。本文采用的复合酶法提取工艺，将料水比从1:20降低至1:5，酸碱用量也相应减少75 %，并将传统的至少3次反复提取减为1次提取。该提取工艺用酶量少，条件温和易控制，在保证原有收率的基础上，大大降低了生产的环保成本，为枳实中橙皮苷提取工艺的改进提供参考依据。