杜晓韵，张兴群*，张晓彦

（1.东华大学 化学化工与生物工程学院，上海 201620；2.华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 201620）

邻苯二甲酸酯（phthalate ester，PAE），俗称塑化剂，是广泛使用的人工合成有机化学品，由于它具有提高塑料柔韧性、耐用性和可加工性的特点，被广泛应用于工业生产和消费品中，如农药、润滑剂、化妆品及食品包装袋。由于PAE与塑料不是共价键结合，所以在日常的生产、使用及废物处理中，PAE很容易从塑料中渗透并进入环境中[1-2]。近年有报道显示，一些污染工业区及电子废弃物填埋场附近的土壤，被检测出高含量的PAE[3]。这些高污染地点是PAE的重要污染源，随着时间的推移，PAE会从外部环境中转移到食物中，如从被污染的土壤或水中转移到农作物中[4]。PAE在极低浓度下就会干扰人和动物的内分泌系统，长期的PAE污染，有致畸、致癌和致突变的风险。因此，许多环境组织把多种PAE列为优先污染物加以控制[5]。

PAE在自然环境中不易降解，依靠自然水解或光解来消除是不现实的。先进的氧化方式对于污水中的PAE降解是有效的，如光催化氧化、UV光解和臭氧氧化[3]，这些方法在近年都被证实能破坏污水中的PAE，但显然不适用于土壤中PAE的降解。多位学者已从受污染的土壤污泥中筛选到能降解PAE的微生物，并认为降解PAE的最有效途径为微生物介导[6]。微生物降解的本质是酶促反应，因此除了利用菌种本身对土壤进行修复外，提取微生物的降解酶类来进行降解也是一种有效的手段。外源投入的微生物或者降解酶是否能很好地作用于自然环境，是否会对自然环境造成额外的影响，这也是一个重要的研究方向[7]。

本研究以Picrophilus torridusDSM 9790基因组为模板，通过筛选，得到一个高对硝基苯酚丁酸酯（pNPB）水解活性的中度嗜热酶，并对其基本酶学性质进行表征。以邻苯二甲酸二丁酯（DBP）为底物的初步降解实验表明，0.1 mg该酶能在24 h内完全降解5 mmol/L的DBP，当温度提高到60 ℃时，降解的效率提高。该酶可应用于一些高温环境的土壤修复。

1 仪器与材料

1.1 仪器

PCR扩增仪（Bio-rad公司）；EPS-300A电泳仪（天能科技）；生物电泳图像分析系统（上海复日）；Sorvall Legend Micro 17冷冻离心机（Thermofisher scientific）；UV-1800紫外分光光度计，Prominence LC-20AD高效液相色谱仪（日本岛津）。

1.2 材料

1.2.1 菌株及载体E.coliBL21（DE3），E.coliDH5α和表达载体pET-28a(+)为实验室所保存。Picrophilus torridusDSM 9790购自德国菌种库DSMZ。

1.2.2 酶和主要试剂 扩增EstPt 1基因的引物由上海捷瑞生物公司合成，各种限制性内切酶，T4 DNA连接酶，LA Taq DNA聚合酶等分子生物学工具酶购自大连TaKaRa公司，细菌基因组DNA提取试剂盒，质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自北京天根生化，其他试剂均为国产分析纯。

1.2.3 培养基 肉汤（LB）培养基（g/dL）：蛋白胨1.0，酵母粉 0.5，NaCl 1.0，pH 7.0；LB甘油培养基（g/dL）：甘油0.2，蛋白胨1.5，酵母粉0.75，NaCl 0.5，Na2HPO4·12H2O 1.26，KH2PO4 0.3，NH4Cl 0.1，MgSO41.2。

2 方法

2.1 EstPt 1基因的克隆及表达载体的构建

按NCBI公布的Picrophilus torridusDSM 9790嗜热酯酶（NC_005877）基因序列设计引物，引物见表1，下划线部分为引入的限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切位点，根据细菌基因组提取试剂盒的说明提取Picrophilus torridusDSM 9790基因组DNA，以此为模板，进行常规PCR，扩增出嗜热酯酶EstPt 1基因。将扩增产物与pET 28a(+)质粒连接，构建重组质粒pPtoE，并转化到E.coliBL21（DE3）中，成功构建表达EstPt 1基因的菌株。

表1 克隆目的基因的引物

2.2 EstPt 1在大肠杆菌中的表达及纯化

将重组菌接种到含50 mg/L 硫酸卡那霉素（Kan）的LB甘油液体培养基中，于37 ℃，200 r/min振荡培养至OD600达0.4～0.6，加入终浓度为1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）， 37 ℃下诱导表达12 h，之后5000 r/min离心10 min收集菌体，重悬于10 ml预冷的PBS中，进行超声细胞破碎（功率220 W，工作5 s，停3 s，99个循环），破碎液在4 ℃下10 000 r/min离心10 min，上清即为粗酶液。粗酶液过镍柱进行纯化，洗脱液为含100 mmol/L咪唑的PBS缓冲液，对收集到的液体用蒸馏水透析18 h，以去掉咪唑。对经透析的纯酶液进行超滤浓缩，并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测纯度，纯酶用于酶学性质分析。

2.3 酶活性测定

向2.97 μl 50 mmol/L PBS缓冲液（pH 7.0）中加入30 μl 1 mol/LpNPB母液，50 ℃保温2 min，再加入适量的酶液，震荡均匀。检测波长405 nm，每隔10 s记录一个A405值，记录时长1 min[8]。根据以下公式计算酶活性。蛋白浓度通过Bradford方法测定[9]。

式中，∆A405为A405值的变化量，t为反应时间。

2.4 EstPt 1酶学性质的研究

2.4.1 最适pH测定 配制不同pH值的缓冲液：pH 6～8 PBS缓冲液（50 mmol/L），pH 8～9.5 Tris-HCl（50 mmol/L）缓冲液。分别孵育10 min，以pNPB为底物，采用分光光度计测定纯化后的酯酶活性，每个点重复测定3次。所有测定均于50 ℃进行。

2.4.2 最佳反应温度测定 将纯化得到的酯酶分别置于最适pH值下的4～95 ℃的反应体系中，分别孵育10 min，以pNPB为底物，采用分光光度计测定纯化后的酯酶活性，每个点重复测定3次。

2.4.3 热稳定性检测 将纯化后的酯酶置于60，65，70 ℃水浴中，定时取样与底物pNPB反应，检测酶活，每个点重复测定3次。

2.5 对DBP的降解反应

将DBP配制成50 mmol/L的母液，溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，取100 μl加入含900 μl PBS（pH 7.0）的玻璃小试管中，加入50 μl酶液，分别在37 ℃和60 ℃下避光反应。反应结束后，用等体积的乙酸乙酯萃取。萃取液用TLC点板分析。

2.6 TLC分析

用毛细点样管取乙酸乙酯萃取液点样，吹干后放入展开剂中展开。展开剂配方：石油醚:乙酸乙酯:乙酸（10:1:0.5），待展开剂展开到硅胶板前沿位置处取出，235 nm紫外灯下检测。

2.7 HPLC分析

色谱柱：Inertsil ODS-SP C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相为甲醇-水（80:20），检测波长254 nm，柱温40 ℃，流速0.8 ml/min。

3 结果与分析

3.1 EstPt 1基因在大肠杆菌中的表达

以Picrophilus torridusDSM 9790基因组DNA为模板，经PCR扩增得到906 bp的基因片段（见图1），片段大小与预期相符，测序结果表明与NCBI（NC_005877）公布的基因序列一致。重组菌经IPTG诱导和SDS-PAGE蛋白质分析，在35 kD处有明显的特异性表达条带（见图2），该条带与预期结果一致，说明9790基因已成功表达。

图1 重组质粒pPtoE PCR结果

图2 诱导重组菌9790电泳结果

3.2 嗜热酯酶EstPt 1的纯化

经诱导的重组菌超声上清经镍柱亲和层析和100 mmol/L咪唑洗脱，得到活性组分，经SDSPAGE分析，可得到单一的明显的蛋白质条带，说明100 mmol/L的咪唑可洗脱目标蛋白。对粗酶与纯酶进行蛋白浓度和酶活检测，结果见表2。纯化倍数为3.09倍，纯酶的比活达202.3 U/mg。

表2 EstPt 1纯化结果

3.3 EstPt 1的酶学性质

3.3.1 EstPt 1的最适pH值 EstPt 1嗜热酯酶的最适pH值范围见图3，由图3可见，其最适pH值为9.0。pH是决定酶活力的重要因素，该酯酶在偏碱性条件下的活性高于酸性条件下活性。由于底物在≥pH 10的条件下会发生强烈的自水解，因此无法检测。

图3 pH对EstPt 1活性的影响

3.3.2 EstPt 1的最适反应温度 温度对于酶活力也有重要影响，见图4。由图4可见，随着温度上升，EstPt 1酶活力也逐渐升高，当温度高于85 ℃时，酶活下降，所以最适温度为85 ℃。酶在80～90 ℃间相对酶活超过90 %，且在0 ℃仍有16 %的活性，这说明EstPt 1不仅可在高温下发挥作用，在低温环境下也可很好地发挥作用。

图4 温度对EstPt 1活性的影响

3.3.3 EstPt 1的热稳定性 热稳定性是酶的一个重要参数，代表酶能在一定温度一定时间内保持高效水解能力。由图5可见，该酶在60 ℃保温64 h，65 ℃保温12 h，70 ℃保温1 h，残余活力均保持在50 %左右，表明EstPt 1具有良好的稳定性，可用于高温环境中PAE的降解。

图5 热稳定性对比

3.4 EstPt 1降解塑化剂的应用研究

3.4.1 TLC分析结果 结果见图6。由图6可见，DBP分解产物为邻苯二甲酸单丁酯（MBP），其在37 ℃下24 h可被基本降解。

图6 EstPt 1与底物DBP反应24 h后的TLC结果

3.4.2 HPLC分析降解进程曲线 结果见图7。由图7可见，初始30 min内，底物消耗效率基本相同。此后，EstPt 1在60 ℃下对DBP的降解速度快于37 ℃下降解速度。反应2 h后，60 ℃和37 ℃下，底物残留分别为5 %和28 %。 EstPt 1在高温下对DBP降解活性较好，可用于一些高温环境，如高温堆肥，夏季蔬菜大棚内污染土壤的生物修复。

图7 EstPt 1在37℃和60 ℃条件下对DBP的降解效果

4 结论

我们以Picrophilus torridusDSM 9790基因组DNA为模板，获得了能降解PAE的嗜热酯酶EstPt 1，该酶纯化后的比活达到202.3 U/mg，其最适pH为9.0，最适反应温度为85 ℃，具有良好的热稳定性。

EstPt 1还显示出对DBP良好的降解活性，TLC分析结果显示，该酯酶可将DBP降解为单酯MBP；HPLC分析显示，在37℃和60 ℃的温度条件下，DBP在8 h内被完全降解，其中60 ℃下的作用效果较优。这对工业化降解环境中，尤其是高温环境中的塑化剂降解有重要意义。