张杰钰，刘思农，洪思丹，伏 欢，冉莉萍

(扬州大学广陵学院，江苏 扬州 225000)

1 引言

小麦(TriticumaestivumL.)是一种重要的粮食作物，在世界各地广泛种植。我国是小麦的种植大国，小麦的种植面积和产量仅次于水稻(OryzasativaL.)。小麦籽粒中的贮藏物质主要是淀粉和蛋白质，二者分别在胚乳的淀粉体和蛋白体两种细胞器中积累。目前关于淀粉体发育的机理已经研究清楚。但关于小麦胚乳蛋白体的发育过程较为复杂，随着对贮藏蛋白研究的不断深入，人们普遍认为小麦胚乳蛋白体的形成方式有两种，一种是内质网衍生途径，即合成的蛋白质聚集在内质网中出芽生成蛋白体；另一种是高尔基体小泡形成途径，即蛋白质在内质网上合成后先经过高尔基体随后运输到蛋白质贮藏液泡(protein storage vacuole, PSV)中积累形成蛋白体。这两种途径形成的蛋白体其成分不同：通常内质网衍生途径形成的蛋白体中富含HMW-GS，而高尔基体小泡形成途径合成的蛋白体主要聚集LMW-GS和醇溶蛋白。

其中蛋白质从内质网到高尔基体的转运过程主要依赖细胞质中包被蛋白复合体II(coat protein complex II, COPII)介导完成。COPII小泡由5种高度保守的蛋白质构成：胞质GTP酶Ras相关蛋白1(Sar1)、内衣被组分Sec23和Sec24及外衣被组分Sec13和Sec31。随着对COPII小泡研究的不断深入，人们发现Sec24表面分布有多个运输物质结合位点，可以和运输物质的信号肽相互作用，进而将运输物质招募到初期小泡中，它会在COPII小泡介导的蛋白质运输过程中发挥重要作用。Nakano等在不同物种里Sec24有不同数量的亚型，例如，酵母有两个：Iss1/Sfb2和Lst1/Sfb3；拟南芥有三个：Sec24a、Sec24b和Sec24c，每个亚型的功能非冗余且作用不可忽视。近年来人们陆续展开对Sec24的研究，其中研究最多的是Sec24a亚型。最新的系统发育分析结果表明，与COPII小泡的其它组分相比，Sec24a亚型的多样性程度最高。而小麦中关于Sec24基因的研究鲜有报道。在前期研究工作中本课题组对施氮前后的小麦胚乳进行了转录组测序，发现小麦Sec24基因有3个亚型，分别是Sec24a、Sec24b和Sec24c，其中Sec24a受氮素影响显著，它的表达水平与蛋白含量呈正相关。当蛋白质含量升高时，小麦Sec24a基因的表达水平会发生显著的变化。本研究通过半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR对扬麦158的根、幼叶、叶鞘、成熟叶、小穗和籽粒等组织中Sec24基因三个基因亚型的表达量差异进行初步分析，以期为后续探明Sec24a基因对胚乳蛋白体发育和贮藏蛋白积累的分子调控奠定理论基础。

2 材料与方法

2.1 实验材料

供试材料为中筋小麦品种“扬麦158”，种子由扬州市里下河地区农科所提供。分别取幼苗期的根、茎与叶，花粉发育期的幼穗与叶和结实期的颖果(花后8 d)所有样品经液氮速冻后，置于-80 ℃超低温冰箱保存用于RNA提取。

2.2 总RNA提取和cDNA的合成

根据Plant Total RNA Purification Kit试剂盒说明书提取总RNA。用1.5%浓度的琼脂糖凝胶检测RNA片段的完整性，经质检合格后，-70 ℃保存备用。

以总RNA为模板，按照RevertAidTM First Strand cDNA Kit反转录试剂盒说明书取进行反转录。反转录体系包括：20～50 μg总RNA、1 μL Oligo (dT)18；12μL RNase-free的水将之补至12 μL、4 μL 5×RT Buffer、1 μLRNase Inhibitor、2 μL dNTP mix、1 μL Reverse Transcriptase。反转录程序为：42 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min, 反应结束后将反转录得到的cDNA模板放至-20 ℃冰箱中保存。

2.3 半定量PCR(Reverse Transcription PCR，RT-PCR)和实时荧光定量PCR分析(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)

表1为RT-PCR和qRT-PCR的反应引物序列。Actin基因PCR程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。分别以Sec24的三个亚型的基因序列设计的扩增引物进行扩增，RT-PCR反应程序为：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 循环；72 ℃10 min；4℃保存。

qRT-PCR的反应体系共10 μL，主要包括：cDNA稀释液(模板)1 μL，正反向引物各0.3 μL，AceQ qPCRSYBR Green Master Mix 5 μL(Vazyme)，ROX Reference Dye1 0.3 μL，灭菌蒸馏水补足至10 μL。qRT-PCR反应程序为：95 ℃变性1 min，95 ℃(15 s)，60 ℃(30 s)，72 ℃(30 s)，总的40个循环反应。整个反应是在正常运行的Stratagene Mx 3000P仪器上进行。通过溶解曲线来判断引物的特异性和可用性，采用2-△△CT法来分析每一个基因的相对表达量。

表1 各基因及内参基因RT-PCR和qRT-PCR引物序列

3 结果与分析

3.1 基于半定量RT-PCR对Sec24基因的不同亚型的初步表达分析

我们分别对小麦不同器官中Sec24基因的三个亚型Sec24a、Sec24b和Sec24c的表达量进行了半定量RT-PCR分析，结果见图1。从图1中可以看出，Sec24的三个亚型并非是特异性表达的基因，它在小麦的各个器官中均会表达，在根中表达量较高，在旗叶中的表达量最低，尤其是Sec24a基因亚型在旗叶中的表达最少，Sec24c次之。根据图中条带的明暗程度来看，Sec24a基因亚型在不同组织中的表达程度比Sec24b和Sec24c两个基因型的要低。

3.2 基于qRT-PCR对Sec24基因不同亚型的初步表达分析

qRT-PCR分析结果(图2)表明，Sec24的三个基因亚型(Sec24a、Sec24b和Sec24c)在不同器官中均检测到有表达，但表达量高低存在明显差异，从整体水平上看，Sec24a在各器官中的相对表达量要低于Sec24b和Sec24c。分别对不同组织中的同一个基因亚型进行分析，发现Sec24a基因亚型在不同组织中的表达量为：根>花后28d小麦颖果>花后8d小麦颖果>花后18d小麦颖果>茎>幼穗>旗叶；Sec24b基因亚型为：根>花后28d小麦颖果>幼穗>花后8d小麦颖果>茎>花后18d小麦颖果>旗叶；Sec24c基因亚型为：根>花后18d小麦颖果>花后8d小麦颖果>花后28d小麦颖果>茎>幼穗>旗叶。从图2中可以看出，三个基因亚型均在根中的表达量最高，旗叶中的表达量最低，尤其是Sec24c基因型最为明显，该结果与图1所示的相对表达量一致。

图中A 花后8 d小麦颖果；B花后18 d小麦颖果；C花后28 d小麦颖果；D旗叶；E茎；F幼穗；G根；Ta54825为内参基因

图1小麦Sec24基因的三个亚型Sec24a、Sec24b、Sec24c在不同器官中表达半定量结果

4 结语

本研究通过实时荧光定量PCR和半定量RT-PCR对扬麦158的根、幼叶、叶鞘、成熟叶、小穗和籽粒等组织中Sec24a、Sec24b和Sec24c三个基因亚型进行初步的表达差异分析，结果显示这三个基因亚型均不是组织特异性表达的基因，它们能在不同的组织中表达，但表达量之间存在很明显的差异。Sec24基因的三个基因亚型具体行使哪些功能，Sec24a基因亚型怎样调控胚乳蛋白体发育和贮藏蛋白积累，都还需要进一步的实验验证。这些问题的解决或许将有助于深化谷物胚乳贮藏蛋白积累和蛋白体发育机制的研究，而且对我国优质专用小麦品种的选育和加工品质的改良具有重要的科学意义和现实意义。

图中A花后8 d小麦颖果；B花后18 d小麦颖果；C花后28 d小麦颖果；D旗叶；E茎；F幼穗；G根；不同小写字母间的数据存在显著性差异(p<0.05)

图2小麦Sec24基因的三个亚型Sec24a、Sec24b、Sec24c在不同器官中相对表达量