陈耀宇, 王曙光, 孙黛珍

(山西农业大学 农学院， 太谷 030801)

植物衰老是一个内在的细胞编程性死亡过程，最明显的标志是植物器官由绿变黄，原因是叶绿素降解和光合能力的下降[1]。然而，过早地衰老会导致作物品质下降、粮食减产。延缓叶片衰老可在灌浆期维持同化碳向籽粒的供应，从而保证最大粮食产量。

Thomas和Howarth[2]认为持绿是一种植物在花后发育过程中叶片衰老延迟的现象，这种现象可能是由于叶片衰老起始晚或者衰老速率慢引起的。因此，Thomas和Smart[3]依据植物叶片衰老起始的早晚与衰老速率的快慢将持绿突变体分成了5类。A型持绿突变体衰老开始晚，但叶绿素降解速率与野生型相同，延长了光合作用时间。B型持绿突变体衰老开始时间与野生型相同，但叶绿素降解速率较慢，延迟了叶片衰老。C型持绿突变体起始衰老时间和完全衰老时间均与野生型相同但由于叶绿素降解紊乱，叶绿素含量几乎保持不变。D型持绿突变体由于突然冷冻或干燥导致叶片死亡，但叶绿素得以保留。E型持绿突变体在成熟期的叶绿素含量高于野生型，在植株衰亡后其叶绿素还未完全降解。A型、B型持绿突变体属于功能型持绿突变体，在叶绿素得以保留的同时，光合作用的时间延长也增加，因此产量提高。C型、D型、E型持绿突变体属于非功能型持绿突变体，虽然在叶片衰老过程中叶绿素降解缓慢或推迟，但缺乏光合作用的能力[4]。

近年来，利用先进的生物技术手段，已鉴别了一大批持绿突变体，如：STAYGREEN(SGR)[5]、chlorophyll b reductase(CBR)[6]、NON-YELLOW COLORING1 (NYC1)、NYC1-LIKE (NOL)[7]、pheophorbide a oxygenase(PAO)[8]、pheophytin pheophorbide hydrolase (PPH)[9]等，这些突变体都是由于叶绿素降解相关基因的缺失或突变而形成的(表1)，其中SGR1/NYE1突变体的发现对于研究植物叶绿素降解机制具有重要的作用[10]。本文叙述了SGR的功能、SGR与叶绿素代谢、SGR调控的最新研究进展，为解析作物叶绿素降解机制提供参考。

表1 叶绿素代谢相关基因及持绿突变体

1 SGR的功能

孟德尔的绿粒豌豆被广泛应用于遗传原理的研究，而控制绿粒豌豆非黄化性状的单隐性基因多年来也一直被科学家所关注。Armstead和他的同事们将控制孟德尔绿粒豌豆性状的基因命名为SGR1或NYE1[11]。Wang等[12]以大白菜nye突变体为材料，精细定位了BrNYE基因，Jiang等[5]利用水稻sgr突变体，克隆了OsSGR基因。Sato等[13]通过对豌豆和水稻的sgr突变体的研究发现衰老后期突变体的叶绿素含量较高，因此他们认为SGR能够促进叶绿素的降解。

系统发生分析表明高等植物的SGR蛋白质可以被划分为两类[14]：一类为SGR亚族，包含能引起持绿突变的保守结构域；一类为SGRL亚族，SGRL蛋白的C端序列与SGR蛋白的C端序列有很大不同，但在不同的植物中也具有高度保守的结构。所有的高等植物至少含有一种SGRL蛋白，可能含有两种或多种SGR蛋白[15]，并都被定位到叶绿体上[14]，这也表明SGR可能在质体中起作用，与叶绿素代谢相关联。研究发现，随着草莓果实的成熟，SGR蛋白活性逐渐升高，在完熟时达到最高，此时叶绿素迅速降解。拟南芥基因组中包含3种SGR同系物SGR1/NYE1(At4g22920)、SGR2(At4g11910)和SGRL(At1g44000)。在拟南芥叶片衰老过程中，SGR1以叶绿素a为底物去除镁离子，而SGRL以脱植基叶绿素a为底物脱去镁离子，SGR1和SGRL均是促进叶绿素降解的正向调节因子且SGR1发挥关键作用[15]。对于拟南芥SGR2的研究目前仍有争议，Sakuraba等[16]研究发现，不同于SGR1，SGR2的过表达植株为持绿植株，而sgr2-1突变体在盐胁迫、高温胁迫、干旱胁迫等非生物胁迫与黑暗诱导处理下表现出早期叶片黄化，这表明SGR2是调节叶片衰老的负向调节因子。Wu等[17]发现在sgr1-1与WT拟南芥植株中过表达SGR2均促使叶片衰老加快，在衰老过程中sgr2-1突变体相对于WT有更多叶绿素得以保留，这表明SGR2是独立于SGR1之外的与叶绿素降解相关的正向调节因子，同时，启动子交换实验表明在叶片衰老过程中SGR2的表达量低于SGR1，这说明SGR1在叶片衰老过程中起主要作用。过表达SGR1、SGRL的水稻植株在黑暗诱导衰老过程中表现出早期的叶片变黄现象，表明水稻中SGRL的功能与SGR1相类似，均能促进叶绿素降解[18]。与拟南芥类似，大豆也包含SGR1/D1、SGR2/D2和SGRL 3种SGR蛋白，而且大豆的d1突变体、d2突变体、d1d2双突变体均能产生持绿表型，这表明在叶片衰老过程中D1、D2均能促进叶绿素降解[19]。任钧等[20]认为大豆中受SGR1和SGR2调控的持绿性状可能是源自于同一个早期变异事件。不同于陆地植物，莱茵衣藻等微细胞藻类的SGR同系物的C端得以延伸，有一个长的亲水基，不能归于SGR亚族与SGRL亚族。莱茵衣藻的SGR蛋白，能在大肠杆菌表达系统中表达促使叶绿素降解，而拟南芥的SGR蛋白不能在大肠杆菌表达系统中表达[21]。

除与叶绿素降解相关外，SGR还具有其他功能。在拟南芥中过表达SGR后，叶绿素a与叶绿素b含量都会下降，而SGR并不能降解叶绿素b，这表明SGR能够诱导叶绿素b还原为叶绿素a。叶绿素b还原酶可由两种基因编码，分别为NYC1与NOL，在拟南芥nyc1突变体与nyc1nol双突变体中过表达SGR会使叶绿素b降解受阻，而在拟南芥nol突变体与野生型中过表达SGR后叶绿素b均能降解，这表明在拟南芥中过表达SGR会促进NYC1的表达[22]。种子成熟过程中种皮会褪绿，因为叶绿素的残留不利于种子贮藏，在香蕉和大蕉果的后熟黄化过程中SGR蛋白的活性会逐渐升高[15]，拟南芥的sgr1 sgr2双突变体与abi3突变体都会产生绿色的种子[16]，在abi3突变体过表达SGR1、SGR2又会使种皮变黄，这表明SGR在种皮褪绿中起关键作用。

Fang等[19]通过酵母双杂交与双分子荧光互补实验研究发现，SGR1能直接或间接地与NYC1、NOL、HCAR、PPH、PAO及RCCR这6种叶绿素降解相关酶(CCE)在LHCII中发生生理互作，而且不同SGR蛋白之间还会形成同源或异源二聚体。为研究SGR2的互作能力是否与SGR1相同，他们又同时对SGR1、SGR2进行了酵母双杂交实验并通过pull-down实验验证，结果表明SGR2与这6种CCEs相互作用的能力受到了很大的限制。在正常衰老叶片的叶绿素降解过程中SGR1与NYC所形成的复合体起主要作用，而在胁迫诱导导致的叶绿素降解衰老过程中SGRL与NOL所形成的复合体起主要作用[16]。这些由SGR、CCEs和LHCⅡ在衰老过程中形成的多蛋白复合物可能是非衰老绿色组织中去除有毒中间产物所必需的[16]。

2SGR与叶绿素代谢

叶绿素及其衍生物在光合作用中起着至关重要的作用，光合作用中的大多数叶绿素分子都能捕获光能并将其转移到光合作用中心。大多数绿色植物有两种不同的叶绿素，叶绿素a和b的生物合成途径已经得到了广泛的研究[23]，5-氨基乙酰丙酸在经过诸多反应后合成叶绿素a，在叶绿素合成的最后一步中，一部分叶绿素a在chlorophyllide a oxygenase(CaO)作用下会转变为7-羟甲基叶绿素a与叶绿素b[14]，但降解途径目前尚有争议。叶绿素的降解从叶绿素a开始，叶绿素b含7-羟甲基不能直接被降解，只有转化为叶绿素a才会被降解[20]。而关于叶绿素a的降解目前认为有两种途径：第一种途径为叶绿素a在降解过程中先脱去镁离子再脱植醇产生脱镁叶绿酸a[24]；第二种途径为叶绿素a在降解过程中先脱去植醇再脱镁产生脱镁叶绿酸a[25]。

脱镁是叶绿素a降解的关键一步，是在脱镁螯合物酶的作用下失去中心镁离子形成脱镁叶绿素a并释放电子[26]，同时脱镁对photosystem II(PSII)的形成也至关重要，因为PSII的合成始于D1/D2复合体的形成，而脱镁叶绿素a正是这一复合体不可或缺的组成部分[27]。Park等[14]发现拟南芥中SGR基因编码了脱镁螯合物酶，他们将SGR-FLAG重组蛋白导入小麦原生质体中，通过高效液相色谱法检测叶绿素及其衍生物的含量变化，发现与对照组相比，导入SGR1、SGR2重组蛋白的实验组叶绿素a含量下降，脱镁叶绿素a含量上升，导入SGRL重组蛋白的实验组脱植基叶绿素a含量下降，脱镁叶绿酸a含量上升。这表明在拟南芥中，SGR1与SGR2是第一种途径中的脱镁螯合物酶，能脱去叶绿素a的镁离子形成脱镁叶绿素a；SGRL是第二种途径中的脱镁螯合物酶，能脱去脱植基叶绿素a的镁离子产生脱镁叶绿酸a(图2)。此外，Matsuda等[21]发现在能够表达衣藻SGR蛋白的大肠杆菌表达系统中加入叶绿素a后，脱镁叶绿素a含量增加，当加入叶绿素b或其他叶绿素同系物时，叶绿素及其同系物无明显变化或变化较小，这表明衣藻SGR能够特异性的降解叶绿素a。

叶绿素降解过程中产生的脱镁叶绿酸a会继续在PAO[8]的作用下氧化产生红色叶绿素分解代谢物，随后再通过RCCR(red chlorophyll catabolite reductase)转变为荧光叶绿素分解代谢物。

3 SGR的调控

SGR1与SGR2的结构相似，SGRL与二者相比稍有差异，因此这3种基因的表达可能会有所不同。拟南芥在正常生长的长日照条件下，SGR1、SGR2的表达水平在4周内迅速上调，而SGRL的表达在前3周呈上升趋势，之后下降；在黑暗处理下，SGR1、SGR2的表达上调在第3天达到峰值，而SGRL在黑暗中的表达迅速下调[16]。

Chlide a:脱植基叶绿素a； Chlide b:脱植基叶绿素b; Chl a:叶绿素a; Chl b:叶绿素b; Phein a:脱镁叶绿素a; Pheide a:脱镁叶绿酸a; RCC:红色叶绿素分解代谢物; pFCC:荧光叶绿素分解代谢物; CaO:叶绿素a氧化酶; CS:叶绿素合成酶; CBR:叶绿素b还原酶; HCAR:7-羟甲基叶绿素a还原酶; CLH:叶绿素酶; SGR:脱镁螯合物酶; PPH:脱镁叶绿素酶; PAO:脱镁叶绿酸a加氧酶; RCCR:红色叶绿素降解产物还原酶

图1 叶绿素代谢途径
Figure 1 Chlorophyll metabolic pathway

SGR的表达受到转录因子的调控，如WRKY与NAC。WRKY 53是一种由H2O2诱导的氧化还原敏感基因，它通过反馈编码一种自身调节其自身合成的转录因子[28]。WRKY 53能与衰老相关基因相互作用，下调WRKY 53的表达水平会延缓衰老。生物信息学分析表明这种转录因子是衰老调控网络中的一种早期作用成分，可能会调节SGR基因的表达。对NAC转录因子的研究发现，小麦6号染色体上的NAC转录因子基因GPC正向调节衰老起始[29]。下调GPC的转录水平，会使小麦叶片衰老延迟24 d，这表明NAC可能会调节SGR的表达。进一步研究发现，在拟南芥中有3种NAC转录因子ANAC046、ANAC087和ANAC100可以直接结合到NYC1、SGR1、SGR2与PAO的启动子区域，从而调控这些叶绿素降解相关酶基因的表达，其中ANAC046是叶片衰老的正调节因子[30]。

ABI3、ABI5、EEL都是ABA信号相关转录因子，ABI3能与SGR1、SGR2启动子区域的B3结构域(CATGCA)结合[31]，在黑暗诱导衰老条件下，光敏色素相互作用因子PIF4与PIF5能明显激活SGR1的表达。在依赖PIF4/PIF5调控衰老的叶片中，ABI5与EEL能直接结合到SGR1启动子区域的ABA响应元件结构域(YACGT)上。除此之外，ABA响应元件结合因子ABF2/3/4也能调控SGR1的表达。这表明ABA信号在SGR1表达的激活和叶绿素降解中起着重要的作用。有意思的是，在黑暗诱导衰老下，NYC1也能直接被ABI5、EEL转录因子激活，在种子成熟褪绿过程中ABF4也起到调控作用。在水稻中ABA信号相关转录因子OsNAP直接激活SGR1与NYC1的转录，从而促进SGR1与NYC1的表达，并对叶片衰老与种子褪绿起重要作用[11]。

植物叶片衰老受到激素的调节[32]，细胞分裂素能够抑制衰老，拟南芥ore12-1是一种功能型持绿突变体，它的细胞分裂素受体基因AHK3不需要其他因子的诱导能够稳定表达，而有的拟南芥持绿突变株系在衰老过程中对乙烯的反应延迟[29]。Jiang等[5]通过激素离体处理水稻幼苗叶片发现，脱落酸会促进SGR的表达，而细胞分裂素则会抑制SGR的表达，这表明SGR的表达还受外源激素的调节。

4 展望

20世纪初，育种家在品种选育时兼顾了高产性与持绿性,到了20世纪70年代末，持绿性已经被明确确定为玉米等商品粮的优良特性，持绿品种具有巨大的市场潜力[4]。SGR基因在植物叶绿素降解和持绿品种的挖掘中起重要作用，虽然近年来SGR基因的功能与表达模式已被广泛研究，但仅限于拟南芥、水稻等模式作物中，我国主要粮食作物小麦、玉米等的SGR基因结构与功能尚不清楚，还需要进一步研究。今后应主要围绕4个方面展开研究：1)利用祖先物种区分小麦等异源多倍体作物每个染色体组的SGR序列，以此来确定进化规律；2)对SGR基因的表达模式进行分析，研究SGR基因的表达部位、表达量与叶片衰老时期的关系；3)构建RNAi、CRISPR-Cas9及过表达载体进行转基因功能验证，与此同时利用高效液相色谱法检测叶绿素及其代谢产物的含量；4)利用酵母双杂交、双分子荧光互补、免疫共沉淀等方法来确定SGR蛋白与叶绿素降解相关蛋白的相互作用。

随着研究的深入，作物衰老的分子机制必将会更加明晰，利用分子育种手段选育持绿型作物品种将具有广阔的前景。