王野影， 粟海军， 熊 勇， 张明明

(1. 贵州师范大学 生命科学学院 植物生理与发育调控重点实验室, 贵阳 550025; 2. 贵州大学 生物多样性与自然保护研究中心, 贵阳 550025)

夜鹭(Nycticoraxnycticorax)隶属于鹈形目(Pelecaniformes)鹭科(Ardeidae)夜鹭属(Nycticorax)。依据IOC World Bird List (v 7.3)提供的数据，夜鹭属曾经包含6个种，目前4个狭域分布种已灭绝，仅剩存两个广布种夜鹭和棕夜鹭(Nycticoraxcaledonicus)。其中夜鹭在除澳大利亚外的全球各区域均有分布(https://www.hbw.com/species/black-crowned-night-heron-nycticorax-nycticorax)，种下分为4个亚种，分别为夜鹭福克兰群岛亚种(Nycticoraxnycticoraxfalklandicus)，主要分布在福克兰群岛；夜鹭美洲亚种(Nycticoraxnycticoraxhoactli)，主要分布在加拿大南部到阿根廷北部，智利和夏威夷；夜鹭指名亚种(Nycticoraxnycticoraxnycticorax)，主要分布在欧亚大陆南部到印度尼西亚和非洲；夜鹭火地岛亚种(Nycticoraxnycticoraxobscurus)，主要分布在智利和阿根廷西南部。由于其全球分布，又存在物种分化，亚种形成的现象，所以作者认为其是探讨物种分化原因的一个理想物种。

近年来，关于夜鹭的研究集中在多个领域，如夜鹭的越冬生态、繁殖生态研究[1-2]、巢址选择[3]、迁徙行为[4]等。因夜鹭和夜鹭卵可富集重金属，被认为是良好的生态指示种[5]，目前针对夜鹭或者卵的重金属富集特征已开展多项研究[6-7]。国外有学者致力于研究夜鹭的免疫和生殖健康评价[8]。但关于夜鹭的系统发育位置及谱系地理学研究较少，且目前所有研究均未涉及有关夜鹭物种分化问题的探讨。

线粒体基因数据是研究鸟类进化的主要数据来源[9]。线粒体细胞色素C氧化酶亚基I (Cytochrome c oxidase I，COX1)基因由于具备蛋白编码基因所共有的特点，即密码子第3位碱基不受自然选择压力的影响可以自由变异；又因自身携带足够的变异位点，且容易被扩增等优点，被广泛用于物种界定和亲缘关系分析中。本文以来自贵州草海的夜鹭的COX1基因结合从GenBank数据库中下载的夜鹭的COX1基因序列，采用分子系统发育和分歧年代评估相结合的方法，对夜鹭的分化问题进行探讨。目的是从分子水平上揭示夜鹭的分化原因，为后续研究全球分布种的物种分化问题奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

所用实验材料为作者于2016年12月，在贵州省草海国家级自然保护区获得的不明原因死亡夜鹭指名亚种一只(由于空间有限，在下文中的表1及图3中仅标识为Ny.nycticorax)，取颈后部肌肉组织约0.5 g，浸泡在无水乙醇中，带回实验室，-4℃冰箱保存直至提取其DNA。另外包含从GenBank上下载的来自不同国家的19只夜鹭、4只白鹭属鸟类及4只朱鹮的COX1序列。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用SDS法进行DNA提取[10]，从所取得夜鹭肌肉组织中提取总DNA，提取出的DNA加入100 μL无菌水溶解，于-20℃冰箱保存。

1.2.2COX1基因扩增及测序

用于扩增夜鹭COX1基因的引物、反应体系及反应程序均参考Folmer等的研究[11]，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。扩增的COX1基因片段长度约为650 bp，1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，条带单一且位于D2000 DNA Marker(天根生化科技有限公司)中的500～750 bp条带之间，则直接送上海生工生物工程有限公司进行测序，测序采用Sanger法。

1.2.3COX1基因的饱和性分析

使用DAMBE5.2.30软件[12]进行COX1基因第3位碱基的替换饱和分析，结果如图1。当F84距离为1.9363时，Ts和Tv相等，随后曲线有下降趋势，并未呈现线性关系，出现了饱和现象，因此，在后续的分析中，均去除第3位密码子。

图1 夜鹭COX1基因第三位碱基的替换饱和性分析

1.2.4 系统发育树的构建

将测得的夜鹭COX1基因序列整理成Fasta格式，进入NCBI Blast网站进行序列比对。确保所获序列来自夜鹭，同时下载GenBank上已有的夜鹭COX1基因序列以及外群序列，外群序列参考Zhou等的研究[13]，选用与夜鹭属鸟类亲缘关系较近的白鹭属(Egretta)部分鸟类作为外群，进行后续的系统发育分析所有序列整理成一个Fasta文件，序列详细信息详见表1。

使用EMBL-EBI的在线工具MUSCLE online(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)程序对整理的Fasta文件中共24条序列进行多重比对。使用Jmodeltext[22]软件对比对好的文件进行模型计算，获得用于系统发育分析的最优模型为GTR+I+G。使用MEGA7[23]和MrBayes 3.2.1 (http://mrbayes.sourceforge.net/download.php)软件，分别采用NJ (Neighbor-Joining)法和贝叶斯法(Bayes)构建系统发育树。构建NJ树时选择GTR模型，1000次重复。BI树计算时，使用4个马尔科夫链，同时进行两次独立的runs，起始树设为随机，共计运行1000万代，将起始的250万代系统树(25%)作为burn-in删除。运行1000万代后，两个独立分析的相似度已小于0.01，结束运算。由于贝叶斯法计算时只能选择一个外群，所以本研究仅用Genbank登录号为GQ481726的白鹭属的一个物种，作为外群。使用Figtree v1.4 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)进行进化树的查看。Adobe Illustrator CS4进行两种方法构建的进化树的编辑和整合。

表1 本研究所使用的夜鹭线粒体COX1基因信息

注：序列来源中无参考文献部分表明，序列来自NCBI，但相关文章未发表

1.2.5 分歧年代评估

使用BEAST v1.6.1软件[24]进行夜鹭分化时间的估算，由于鸟类化石比较少，没有选用到合适的化石进行本研究时间点的矫正。本研究利用Pacheco等人依据化石记录对鸟类多个目进行的分歧时间推断结果[9]，鹈形目和鹳形目(Ciconiiformes)中的黄嘴白鹭(Egrettaeulophotes)的分化时间发生在68.92百万年，鹳形目中的东方白鹳(Ciconiaboyciana)和白鹳(Ciconiaciconia)与企鹅目(Sphenisciformes)中的凤头黄眉企鹅(Eudypteschrysocome)和小蓝企鹅(Eudyptulaminor)的分歧时间发生在67.12百万年，而鹈形目和企鹅目的分歧时间发生在72.25百万年，特此，本研究选用这3个时间结点作为校正点，将GenBank下载的朱鹮COX1基因序列(序列信息见表1)和夜鹭COX1基因序列整理成一个FASTA文件，使用MEGA7转换成可用于BEAST分析的格式。分析时采用放松的分子钟模型(the relaxed molecular clock models)，依据Jmodeltest结果，采用GTR+gamma+I模型，树的先验值计算选择Yule progress模型，共计运行1000万代，每1000代进行一次抽样，最后将100万代(10%)作为burn-in进行舍弃。使用Tracer v1.6(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/tracer/)评估结果的稳定性，Figtree v1.4进行树文件的查看。Adobe Illustrator CS4进行树文件的编辑和美化。

图2 基于COX1基因构建的夜鹭的系统发生树，拓扑结构来自最大似然树(分支上的支持度依次为BI/NJ)

2 结果与分析

2.1 系统发育发生关系分析

采用最大似然法和贝叶斯法，基于线粒体COX1基因构建的来自不同国家的20只夜鹭的系统发育树，结果如图2。两种方法构建的系统发育树，拓扑结构一致，以最大似然树的结构进行展示。在系统发育树中，可见以作为外群的白鹭属单独为一支系，很好地和内群夜鹭分开，并未存在长枝吸引问题，说明白鹭属是夜鹭属可靠的外群。夜鹭整体分为两个支系，一支由来自中国、印度、日本、伊拉克和韩国的夜鹭构成，本研究称之为亚洲支系；另一支系由来自美国、厄瓜多尔共和国和阿根延的夜鹭组成，本研究定义为美洲支系。亚洲支系和美洲支系互为姐妹群，分支支持率分别为1和100%，说明亚洲和美洲的分离即地理隔离可能是导致夜鹭分化的主要因素，长期的地理隔离导致生殖隔离。亚洲支系内部和美洲支系内部也存在分化，支持率均在0.85以上，说明夜鹭在各自生活的大洲上均持续进行着独立进化。

2.2 分歧年代分析

使用BEAST软件，基于夜鹭和朱鹮的线粒体COX1基因，使用鹈形目和鹳形目的分歧时间点68.92百万年、鹳形目和企鹅目的分歧时间结点67.12百万年及企鹅目与鹈形目的分歧时间结点72.25百万年作为校正点，Tracer中，观察到ESS值大于200，说明BEAST软件中各参数设置合理，最终得到的夜鹭的分歧时间树(见图3)。由图3可见，夜鹭依然分为亚洲支系和美洲支系，再次说明夜鹭的分化与亚洲板块与美洲板块的分离有关；支系内具体的地点可见图2或者表1，两支系的分歧时间发生在距今约56.74百万年，说明两世系的分化发生在新生代早第三纪古新世。美洲支系在距今约35.34百万年再次发生分化，这一节点处于新生代早第三纪始新世。亚洲支系在距今约36.68百万年发生了分化，分化时间依然处于早第三纪始新世。但从分化时间上可知，亚洲支系的分化略早于美洲支系。

图3 基于线粒体COX1基因推测的夜鹭的分化时间图(分支上的数字表示分歧时间, 单位：百万年)

Figure 3 Chronogram showing estimated dates of divergence among Black-crowned Night Heron lineages (Numbers on each branch refer to divergence time, unit: million years)

3 讨论

本研究通过系统发育树的构建和分歧年代评估的方法探索了夜鹭的进化历史。BEAST被认为是评估物种分歧年代的一个可靠软件，运算结果与MDT软件运行结果相似[9]，因此本研究仅选用BEAST进行分歧时间的估算，结果表明：夜鹭第一次分化发生在新生代早第三纪始新世赞尼特期(距今56.0～59.2百万年)，晚于现代鸟类的辐射时间，65百万前的白垩纪-第三纪又称K-T边界[25]，再次证明分歧时间推断的合理性和准确性。这一分化时间与鸽形目(Columbiformes)的分化时间相似[26], 说明夜鹭和鸽形目鸟类的祖先并没有在大灭绝事件(65百万年)中灭绝，而是继续发生演化。夜鹭的分化时间早于许多鸟类，如暗腹雪鸡(Tetraogallushimalayensis)的分歧时间发生在中更新世[27]，环颈雉(Phasianuscolchicus)的分歧时间发生在晚更新世[28]，大山雀(Parusmajor)的分歧时间发生在早-中更新世[29]，说明夜鹭也是一个比较古老的类群。

新生代以来，地壳的演化已与现代十分相似，欧洲、亚洲、非洲、美洲等持续向当今位置漂移。在始新世，植物和海洋动物区系与现今十分接近，许多现代鸟类也是在这一时期首次出现，本研究只能证明夜鹭在这一时期出现了分化，无法证明其是否首次出现。夜鹭的亚洲支系和美洲支系的再一次分化均发生在始新世的普里阿邦阶(33.9～37.8百万年)，美洲支系的分化略晚于亚洲支系。生物大灭绝事件(extinction event)发生在始新世晚期，所以亚洲和美洲支系的分化，可能与生物大灭绝事件有关。全球变冷的趋势也发生在始新世晚期，因此，亚洲和美洲支系的分化也可能与气候有关。在始新世，各大洲都在向当今所在位置漂移，所以研究结果支持大陆漂移学说，支持大陆分离是禽类物种形成事件的驱动力这一理论[30]。

由于缺乏分布于欧洲和非洲的夜鹭的COX1基因，本研究无法全面探讨夜鹭的进化历史，无法理清夜鹭在气候变暖、气候变冷等极端环境下是如何生存的，无法给出明确解释亚洲大陆生存的夜鹭与美洲生存的夜鹭是否通过白令海峡进行交流，这些问题在后续可获得这部分样本时，将进一步讨论。

4 结论

本研究通过对涵盖亚洲和美洲不同国家的20只夜鹭样本，进行系统发育分析和分歧年代评估，并与其他已有相关研究成果进行对比，得出以下结论：1) 夜鹭整体分为亚洲支系和美洲支系两个支系，分歧时间为56.74百万年左右，分歧原因可能是大陆分离导致的；2) 亚洲支系和美洲支系的分化可能与生物大灭绝事件或者气候变冷有关。