崔莺文， 李文明， 钱燕萍， 田如男， 李云龙

(1. 南京林业大学 风景园林学院， 南京 210037；2. 中国科学院植物研究所 南京中山植物园， 南京 210014)

欧洲冬青为冬青科(Aquifoliaceae)冬青属(IlexL.)常绿灌木或小乔木，原产于欧洲[1]，喜温暖、湿润气候条件；树形优美，既可观叶又可观果，具有良好的应用前景。我国先后从不同国家和地区引进了50余种(含园艺品种)，并建立了种质资源圃。曾雯等对引进的9个杂种冬青(Ilexsp.)品种进行抗寒性试验，发现均能在北方推广，这为向更高纬度地区引种及推广应用提供了理论依据[2]。本试验以欧洲冬青原种、2个欧洲冬青园艺杂交种和2个欧洲冬青品种为材料，进行人工低温处理，测定5种供试材料在不同低温下的生理生化指标，运用主成分分析法和隶属函数法进行综合评价，为其在南京地区的引种栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验以江苏省中国科学院植物研究所提供的两年生欧洲冬青原种、2个欧洲冬青园艺杂交种(‘长叶阿尔塔’、‘金心阿尔塔’)和2个欧洲冬青品种(‘布利奥特夫人’、‘小宝石’)扦插苗为试验材料。

1.2 试验设计

分别从每种供试材料的枝条顶端取第4～6片完全展开叶，每种供试材料取50片，采摘后立即用湿纱布包裹，装入自封袋，带回实验室进行试验。将5种供试材料分别分成8组，用纱布包好，置于人工气候箱，在8℃停留一周，然后降温至4℃，停留12 h，取出第1组；继续降温至0℃，停留12 h，取出第2组；以此类推，直至降温至-24℃，取出第8组。以4℃为对照，每处理重复3次。

将低温胁迫处理后取出的样品置于4℃冰箱内解冻24 h，然后进行各项生理指标的测定。

1.3 指标测定

参照王学奎[3]的方法，测定相对电导率、MDA含量、SOD活性、可溶性糖含量和叶绿素总含量。

1.4 数据分析

通过电导法配以Logistic方程Y=K/(1+ae-bx)计算5种供试材料的低温半致死温度(LT50)[4]。

采用主成分分析法和模糊隶属函数法综合评价5种供试材料的抗寒性[5]。首先，运用主成分分析法计算各指标的权重系数，采用模糊隶属函数法计算各指标的隶属函数值；然后，将对应的权重系数与隶属函数值相乘，对各指标进行合成并计算抗寒性综合指数，根据抗寒性综合指数进行抗寒性评定。

用Microsoft Excel 2007和SPSS20.0统计软件对试验数据进行计算和方差分析。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫下5种欧洲冬青的低温半致死温度

在低温胁迫下，5种供试材料的相对电导率随着处理温度的降低呈“S”型曲线上升，但不同供试材料的上升幅度相差较大。通过Logistic方程拟合，求出5种供试材料的低温半致死温度(表1)。5种供试材料的LT50在-13℃～-24℃之间，‘长叶阿尔塔’、‘金心阿尔塔’、‘欧洲冬青原种’、‘布利奥特夫人’、‘小宝石’的低温半致死温度分别为-24.2℃、-13.1℃、-21.0℃、-15.1℃、-15.3℃。当温度降低到-16℃时，‘布利奥特夫人’叶片的部分边缘由黄色变为褐色，呈煮熟状；‘金叶阿尔塔’叶片边缘变为褐色，中间叶片出现锈色斑点；‘小宝石’叶片背面出现褐色斑点，‘长叶阿尔塔’和‘欧洲冬青原种’变化不大。

表1 5种供试材料的低温半致死温度(LT50)及拟合度(R2)

2.2 低温胁迫下5种欧洲冬青的MDA含量的变化

在低温胁迫下，5种供试材料的MDA含量随着处理温度的降低呈先上升后下降的趋势(表2)。在-12℃时，‘长叶阿尔塔’、‘金心阿尔塔’、‘布利奥特夫人’和‘小宝石’的MDA含量达到最大值，分别比对照组高28.7%、28.5%、26.30%和37.78%。在-8℃时，欧洲冬青原种的MDA含量达到最大值，比对照组高51.97%。

表2 低温胁迫对5种供试材料MDA含量的影响

注：表中数值为平均值±标准差，同列不同字母表示差异显著(P<0.05)；下同

2.3 低温胁迫下5种欧洲冬青的SOD活性变化

在低温胁迫下，5种供试材料的SOD活性随着处理温度的降低变化趋势相同，均呈先下降后上升再下降趋势，但增加幅度不同(表3)。在-12℃时，5种供试材料的SOD活性出现高峰，但比对照组低，‘布利奥特夫人’的SOD活性降幅最大，比对照组低23.96%。

表3 低温胁迫对5种供试材料SOD活性的影响

2.4 低温胁迫下5种欧洲冬青的可溶性糖含量变化

在低温胁迫下，5种供试材料的可溶性糖含量随着处理温度的降低呈先下降后上升再下降的趋势(表4)。在-12℃时，‘金心阿尔塔’、‘欧洲冬青原种’、‘布利奥特夫人’的可溶性糖含量达到最大值，分别比对照组高41.06%、26.77%和25.47%。在-20℃时，‘长叶阿尔塔’和‘小宝石’的可溶性糖含量达到最大值，分别比对照组高23.79%及23.21%。

表4 低温胁迫对5种供试材料可溶性糖含量的影响

2.5 低温胁迫下5种欧洲冬青的叶绿素总含量变化

在低温胁迫下，5种供试材料的叶绿素总含量随着处理温度的降低而下降(表5)。在-24℃时，‘长叶阿尔塔’、‘金心阿尔塔’、‘欧洲冬青原种’、‘布利奥特夫人’和‘小宝石’的叶绿素总含量达到最小值，分别比对照组低58.01%、45.59%、67.26%、70.88%及55.16%。

表5 低温胁迫对5种供试材料叶绿素总含量的影响

2.6 5种欧洲冬青抗寒性综合评价

2.6.1 抗寒性综合评价体系的建立

植物的抗寒性是相关指标综合作用的结果，需建立抗寒性综合评价体系，对实验结果进行主成分分析。一般认为，主成分分析中所提取主成分累计贡献率达到80%以上，就可以用这些主成分对事物的属性进行概括性分析。本研究的前3个主成分的累计贡献率为97.78%(表6)，可以代表原始指标的绝大部分信息。因此，以前3个主成分分析各指标的负荷量，计算各指标对5种供试材料抗寒性的作用大小。从表7可以看出，与5种供试材料抗寒性相关性最大的指标是叶绿素总含量，其次是MDA含量。

表6 5种供试材料抗寒性指标的特征根和贡献率

2.6.2 5种欧洲冬青各指标隶属度值及抗寒性综合指数

通过隶属函数法求出各指标的隶属函数值，再乘以对应的权重系数，累加求和得出综合评定值。该值越大，抗寒性越强，并结合相关的抗性指标进行分析，则能较为准确的判断供试材料抗寒性强弱。从表8可以看出，5种供试材料的抗寒性强弱为：‘长叶阿尔塔’>‘小宝石’>‘欧洲冬青原种’>‘布利奥特夫人’>‘金心阿尔塔’，这与低温半致死温度算出的结果有所差异。

表7 5种供试材料抗寒性指标的负荷量和权重

表8 5种供试材料各指标隶属度值及抗寒性综合指数

3 讨论

在低温胁迫下，植物的外部形态会发生明显变化。因此，可以通过植物外部形态变化来确定其抗寒性，这种方法简单而又直接[5]。在低温胁迫初期，‘金心阿尔塔’和‘布里奥特夫人’出现褐色斑点，其它3种供试材料无明显变化；随着胁迫程度的加剧，5种供试材料均出现不同程度的冻害症状，‘金心阿尔塔’呈煮熟状，汁液外渗。通过外部形态变化发现，‘金心阿尔塔’和‘布里奥特夫人’的抗寒性相对较弱。

在正常情况下，植物细胞膜具有选择渗透性；在低温胁迫下，植物细胞膜会采取保护措施，适应低温环境。当温度降低到一定程度时，植物细胞膜受到不可逆的伤害，细胞膜透性增强，电导率增大，这种变化先于外部形态变化[6-11]。在低温胁迫初期，5种供试材料的相对电导率随着温度的降低而缓慢上升，表明5种供试材料的细胞膜受到伤害；在-20℃时，5种供试材料的相对电导率急剧上升，表明此时供试材料受到的伤害程度最大，这与张富玮等[12]研究结果相同。

在低温胁迫下，植物体内活性氧自由基积累，引发膜脂过氧化，产生大量的膜脂过氧化产物MDA[13]。MDA含量增加，细胞内的蛋白质合成受阻，细胞膜变性，严重时导致细胞受损、衰老甚至死亡。MDA的产生量是鉴定逆境胁迫对植物危害程度的重要指标。在本试验中，5种供试材料的MDA含量随着温度的降低逐渐上升，表明在低温下细胞膜产生大量的MDA，细胞膜受到伤害；MDA含量随着温度的降低而下降，这可能是代谢紊乱产生的结果[14-15]。

在低温胁迫下，植物通过多种抗氧化酶来清除细胞内的活性氧，从而减少细胞的受害程度。抗氧化酶活性越高，植物的抗寒性越强[16-17]。本试验中，5种供试材料的SOD活性均随着温度的降低呈先下降后急剧上升再缓慢下降的趋势，表明低温胁迫下活性氧过量积累，破坏了活性氧和防御系统的动态平衡，导致酶的结构发生改变或酶的表达受到抑制，从而使酶的活性降低；当温度下降到一定程度，5种供试材料的SOD活性突然急剧上升，这可能是植物的保护应激反应，减轻低温对生物膜的迫害。

可溶性糖是植物体内的重要渗透调节物质，可以提高植物的渗透调节能力，增强植物的抗寒性，维持细胞膜的正常功能[18]。本试验中，5种供试材料的可溶性糖含量随着处理温度的降低呈先下降后上升的趋势，抗寒性弱的上升幅度大，这可能是在低温胁迫初期需要较多的渗透调节物质来平衡低温所带来的危害[19]，但与董万鹏等的“可溶性糖含量与植物的抗寒性呈正相关”结论不同[20]。

叶绿素的合成是一系列酶促反应的结果，当植物遭受低温胁迫时，叶绿素的合成受阻，分解加速。在低温胁迫下，叶绿素总含量下降；处理温度越低，叶绿素总含量下降越明显[21]。本试验中，5种供试材料的叶绿素总含量均随着处理温度的降低呈下降趋势，‘长叶阿尔塔’的叶绿素总含量相对较高，表明其抗寒性较其他4种强，该结论已在多种植物中被证实[22-23]。

植物是一个有机整体，受逆境胁迫而引起植物生理生化指标变化的因素错综复杂[24-25]。因此，单一指标很难准确评价植物的抗逆性[26-27]。本试验中，运用隶属函数法和主成分分析法综合评价5种供试材料的抗寒性，‘长叶阿尔塔’抗寒性最强，其次是‘小宝石’和‘欧洲冬青原种’，‘布利奥特夫人’和‘金心阿尔塔’抗寒性最弱。通过低温半致死温度求得的结果与综合评定结果不一致，表明单一指标很难准确评价植物的抗寒性，有必要进行综合评价其抗寒性。另外，综合评价结果与田间观察结果一致。

4 结论

通过主成分分析法和隶属函数法综合评价得出5种供试材料的抗寒性大小依次为：‘长叶阿尔塔’>‘小宝石’>‘欧洲冬青原种’>‘布利奥特夫人’>‘金心阿尔塔’。通过查阅资料发现，南京历史上年最低温有4次低于-13℃，但近20年没有出现过年最低温低于-10℃的严冬[28]。本试验结果发现，5种供试材料的低温半致死温度均低于-13℃。因此，这5种供试材料均具有在南京栽培推广的潜力，且不易受到低温伤害。将这5种供试材料引种驯化到南京，使其适应当地环境，并将其扩繁推广，丰富南京的园林景观。