吴岑，郑志雄，黄志扬，伍伯聪，吕联辉，张巍，张文彬

福建医科大学附属泉州第一医院/泉州市第一医院泌尿外科，福建 泉州 362000

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，具有恶性程度高、复发率高、病死率高等特点，其中远处转移是造成膀胱癌患者死亡的主要原因，近年来其总体发病率和病死率均呈逐年上升趋势[1]。研究发现，约30%的早期膀胱癌可发生转移，近50%的肌层浸润性膀胱癌确诊时已存在微转移灶[2]。循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）是能够逃避免疫监视进入外周血中的存活的肿瘤细胞[3]，与肿瘤的复发和转移密切相关，是肿瘤进行血行转移的前提[4]。作为一种重要的中间转移过程，CTC可以反映膀胱癌实时转移状态，检测外周血中的CTC对判断发生远处转移的风险、预后及选择治疗手段等具有重要意义[5]。目前国内外关于膀胱癌CTC的研究均处于起始阶段。本研究拟选择CTC免疫芯片分选法检测膀胱癌患者外周血中的CTC，研究其在膀胱癌复发和转移早期监测、疗效评价及预后判断等方面的意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2016年1月至2017年6月在福建医科大学附属泉州第一医院泌尿外科首诊的87例膀胱癌患者作为研究对象。纳入标准：①经术后病理确诊为膀胱癌，其中非肌层浸润性膀胱癌为中、高危患者；②美国麻醉医师协会（American Society of Anesthesiologists，ASA）术前分级≤Ⅲ级。排除标准：①不能耐受全部4个疗程的化疗而中途退出者；②因其他原因放弃治疗或转院者。根据肿瘤浸润深度将87例膀胱癌患者进一步分为非肌层浸润组（55例）和肌层浸润组（32例），另选取40例膀胱良性病变患者设为对照组，3组患者的基线特征比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1），具有可比性。本研究经医院伦理委员会审核批准，且所有研究对象均签署了知情同意书。

表1 3组患者的基线特征

1.2 治疗方案

膀胱癌患者参考《中国泌尿外科疾病诊断治疗指南（2014版）》[6]进行治疗：非肌层浸润组患者采用经尿道膀胱肿瘤电切术联合吡柔比星膀胱灌注，吡柔比星溶于5%葡萄糖溶液，浓度500～1000μg/ml，注入膀胱内保持1～2 h，每周1次，共8周，之后维持灌注，每月1次，维持8个月。肌层浸润组患者采用根治性膀胱切除术+尿流改道+淋巴结清扫术，术后采用吉西他滨+顺铂（GC）方案化疗，第1、8、15天给予吉西他滨1000 mg/m2，第2天给予顺铂70 mg/m2，每28天为一个疗程，共4个疗程。治疗过程中监测患者血常规和肝肾功能。

1.3 CTC检测

1.3.1 样本采集 分别在3组患者接受治疗前、非肌层浸润组患者和肌层浸润组患者治疗后每4周后抽取患者外周血5～8 ml，注意弃去前2 ml血液，以免混入表皮细胞导致假阳性，0～4℃枸橼酸盐抗凝剂下保存，24 h内送检。

1.3.2 CTC分离和染色 ①密度梯度离心：用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）将抗凝全血稀释50%，取50 ml无菌离心管加入20 ml Ficoll细胞分离液，再沿管壁缓慢注入稀释全血，室温下1200 r/min离心15 min。弃除上层的血浆和PBS混合液，将单个核细胞层倾倒至另一50 ml无菌离心管中，再加入20 ml PBS重新混匀，4℃400 r/min离心10 min，弃上清。②孵育捕获抗体：加入4～5滴PBS重悬细胞，混匀后倒入1.5 ml无菌离心管。加入兔抗人上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗体，室温孵育1 h后，加入800μl PBS轻柔混匀，400 r/min离心5 min，弃上清，再加入200μl PBS重悬细胞。③CTC分离：将上一步获得的细胞悬液注入EpCAM芯片进行细胞分离，流速为200μl/h。④免疫染色：将芯片拆开置于平皿上，依次用固定剂和透膜剂各处理15 min，然后加入CK8/18/19和CD45一抗，4℃避光孵育24 h。然后用PBS泡洗芯片3次，每次5 min。再加入Alexa488、Alexa555和Hochest33342标记的二抗，室温避光孵育40 min，加入4'，6-二脒基-2-苯基吲哚进行核染色，保持20 min。最后用PBS泡洗3次，每次5 min。

1.3.3 芯片镜检、鉴定及计数 在400倍高倍镜下观察芯片上捕获的细胞，计算CTC阳性细胞数。

1.4 随访

治疗1年内，对所有患者进行每月1次的电话随访。非肌层浸润组患者出院后3个月复查1次膀胱镜，肌层浸润组患者每3个月门诊随访，每6个月复查腹部及盆腔CT，计算复发率。

1.5 统计学分析

采用SPSS 21.0统计软件进行数-据分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，连续测量数据比较采用重复测量方差分析；计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率法，有序分类变量采用秩和检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗前CTC检出数的比较

治疗前，对照组患者外周血中未检出CTC，非肌层浸润组患者CTC检出数为（9.38±11.35）/10 ml，明显少于肌层浸润组患者的（23.28±11.74）/10 ml，差异有统计学意义（t=5.439，P＜0.01）。将CTC按数量分层，非肌层浸润组与肌层浸润组比较，差异有统计学意义（Z=4.725，P＜0.01）（表2）。

2.2 治疗前及治疗过程中CTC检出数的比较

治疗过程中非肌层浸润组和肌层浸润组患者CTC检出数均逐渐减少，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表3）

表2 治疗前两组膀胱癌患者的CTC检出情况[n（%）]

表3 治疗前及治疗-过程中两组膀胱癌患者CTC检出数的比较（/10 ml，±s）

表3 治疗前及治疗-过程中两组膀胱癌患者CTC检出数的比较（/10 ml，±s）

时间治疗前第1个疗程后第2个疗程后第3个疗程后第4个疗程后F值P值9.38±11.35 6.51±8.31 5.69±7.58 4.55±6.37 2.53±4.33 32.515 0.000 23.28±11.74 17.16±10.13 12.31±12.07 6.88±12.53 4.06±9.59 98.337 0.000非肌层浸润组（n=55） 肌层浸润组（n=32）

2.3 复发情况的比较

未检出CTC的非肌层浸润组患者1年复发率为8.00%（2/25），低于检出CTC的非肌层浸润组患者的 53.33%（16/30），差异有统计学意义（χ2=12.729，P＜0.05）；CTC检出数为（0～20）/10 ml及≥21/10 ml的肌层浸润组患者的1年复发率分别为53.85%（7/13）与68.42%（13/19），差异无统计学意义（χ2=0.216，P＞0.05）。

3 讨论

外周血中CTC的检测分析主要包括富集、分选和鉴别等过程[7]，本研究利用肿瘤细胞密度的特性，使用密度梯度离心法将其富集于单核细胞、淋巴细胞等单个核细胞层中，提高了CTC检测的灵敏度[8]。分选技术种类较多，CellSearch系统是目前唯一通过美国食品药品管理局（FDA）批准用于临床CTC检测的技术[9]，其主要原理是将带有磁珠的EpCAM单克隆抗体与CTC结合，置于强大磁场中，从而准确高效地分选出CTC。然而，约30%的膀胱癌细胞发生了间充质转化，EpCAM分子缺失或下调，从而降低了该技术检测CTC的灵敏度[10]。CTC芯片分选法基于微流体学检测技术，在芯片上装有78 000个由EpCAM抗体包被的显微位点，研究显示，CTC捕获率高达99%[11]。

膀胱癌生物学行为复杂、多变，现有的预后判断标志物对预后判断效率十分低下[12]，许多膀胱癌患者在被诊断时，肿瘤仅局限于黏膜层或黏膜下层[13]。本研究显示，治疗前54.55%（30/55）的非肌层浸润膀胱癌患者和96.88%（31/32）的肌层浸润膀胱癌患者外周血中检出了CTC，提示膀胱癌早期血行转移是十分普遍的[14]。但是，Raimondi等[15]研究认为将CTC作为膀胱癌早期诊断指标尚不可取，一是检测费用高，二是灵敏度低于膀胱镜检查。本研究结果还显示，非肌层浸润组患者CTC检出数为（9.38±11.35）/10 ml，明显少于肌层浸润组患者的（23.28±11.74）/10 ml，提示随着肿瘤原发灶的进展，CTC的数量也会进一步上升，与Busetto等[16]的研究结果类似。

Abrahamsson等[17]研究发现，≥1/10 ml的 CTC是膀胱癌患者预后不良的独立危险因素。由于CTC可视为微转移灶及预后的预测指标，美国癌症联合委员会（American Joint Comm ittee on Cancer，AJCC）已将检出CTC的乳腺癌作为AJCC分期标准——cM0，指没有临床或影像学远处转移证据，而存在分子标志物或显微镜观察到的转移肿瘤细胞[18]。对检出CTC的膀胱癌患者行全身化疗是否可获益仍缺乏大样本研究支持。Yin等[19]研究显示，对侵袭性膀胱癌行新辅助化疗有助于延长患者的无进展生存时间。本研究结果显示，肌层浸润性膀胱癌患者的GC化疗方案和非肌层浸润患者的膀胱灌注化疗均能减少CTC数量。提示全身化疗很可能使浸润深度较浅的CTC阳性患者受益。CTC数量变化及能否转阴亦可成为膀胱癌患者治疗效果和预后判断的重要指标[20]。

Gazzaniga等[21]研究报道，44例非肌层浸润膀胱癌患者中，CTC阳性与阴性患者中位无进展生存时间分别为6.5个月和21.7个月，差异有统计学意义。本研究中，未检出CTC的非肌层浸润组患者1年复发率为8.00%（2/25），明显低于检出CTC的非肌层浸润组患者的53.33%（16/30），与以上结果一致。更加有力地证明了CTC与患者预后的关系。然而，CTC检出数为（0～20）/10 ml及≥21/10 ml的肌层浸润组患者的1年复发率分别为53.85%（7/13）与68.42%（13/19），差异无统计学意义。可能是由于现有的一线化疗方案并不能完全清除体内残余的肿瘤细胞[22]。

综上所述，外周血CTC是膀胱癌预后不良的重要标志，对膀胱癌临床疗效评价、预后判断有重要价值，应尽快进行相应的大规模临床试验，评价全身化疗对膀胱癌患者的价值，使患者受益。