吴继云, 陈伟南**, 蒋春华

(1.中国人民解放军联勤保障部队第904医院 & 无锡市太湖医院， 江苏 无锡 214000; 2.广西医科大学， 广西 南宁 530021)

骨质疏松(osteoporosis,OP)是全身性的骨骼疾病，临床典型表现为腰背和四肢关节疼痛，病理学检查以骨密度降低为特征，导致骨骼脆性和骨折危险性增高。50 岁以上人群骨质疏松发病率超过50%，已被公认为严重的社会公共健康问题[1-3]。近年来，中药具有疗效确切和副作用小等特点而广泛应用于临床骨质疏松的治疗，相关研究也日益增多。仙灵骨葆胶囊是收录于现行《国家基本药物目录》并常用于骨伤科骨质疏松症及骨质疏松症相关骨折的中成药，具有滋补肝肾，活血通络及强筋健骨的功效[4-5]。随着人们对骨折愈合机制研究深入，认识到一些细胞因子，如血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)、转化生长因子(transforming growth factor beta,TGF-β)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在骨折愈合中发挥了独特的作用，骨折患者其较快的骨折愈合时间可能与血清中PDGF、TGF-β和VEGF水平升高有关[6-8]。仙灵骨葆胶囊在治疗老年骨质疏松的机理是否与上述因子相关仍需要进一步确认，本课题以去势后骨质疏松性骨折老龄大鼠模型为研究对象，考察仙灵骨葆胶囊对骨折愈合过程PDGF、TGF-β和VEGF表达的影响，为仙灵骨葆胶囊的临床应用提供参考。

1 材料及方法

1.1 受试动物

6月雌性SD大鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号为SCXK(京)2006.0009，体质量280～450 g，随机分为假手术组、去势组、仙灵骨葆胶囊高剂量组(高剂量组)和仙灵骨葆胶囊低剂量组(低剂量组)，每组16只。所有大鼠均自由进食饮水，定期消毒和通风，1周适应性饲养后进行实验。

1.2 试剂与仪器

仙灵骨葆胶囊(贵州同济堂制药有限公司，国药准字Z20025337，0.5 g/粒)。PDGF、TGF-β和bFGF兔抗大鼠单克隆抗体、生物素化山羊抗兔IgG均购自武汉博士德公司。总蛋白定量测定试剂盒(南京建成生物公司)，LEICARM2235 型石蜡切片机(德国莱卡公司)，BX50生物显微镜(日本Olympus公司)，大鼠固定板，克氏针和手术器械等。

1.3 骨质疏松及骨折模型的制备

全身麻醉后，去势组和高、低剂量组大鼠，切开双侧腰背部，暴露腹腔，行双侧卵巢切除术。假手术组切开双侧腰背侧，切除腹腔少许脂肪即可。术后8周，所有动物全身麻醉，暴露右侧股骨，经骸韧带行克氏针髓腔逆行并内固定，将股骨中段切断，制成骨折模型。术后所有大鼠独笼饲养，自由进食进水。

1.4 给药

骨折造模术后第2天高剂量组和低剂量组分别给予0.6及0.3 g/kg仙灵骨葆胶囊，假手术组和去势组给予生理盐水灌胃，连续10周。

1.5 指标检测

1.5.1体质量 检测4组大鼠骨折前、骨折后2周～8周的体质量。

1.5.2骨痂、骨细胞指数与破骨细胞指数 骨折模型建立后2、4、8和10周，每组随机选取4只大鼠，安乐处死，截取右股骨中段骨痴组织，以10%中性甲醛固定，脱钙6周，正中剖开，阶梯浓度乙醇脱水，石蜡包埋，连续切片，染色，镜下观察骨折后不同时期骨痴的组织学改变，每张切片随机取5个视野，计数成骨细胞指数与破骨细胞指数。

1.5.3骨折周围的软组织的PDGF、TGF-β和VEGF表达 骨折造模10周后，收集骨折周围的软组织，包括肌肉及纤维组织等，采用western blot法检测骨折周围的软组织的PDGF、TGF-β和VEGF表达。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 体质量

双侧卵巢切除术术后6周，大鼠无明显动情周期，表明去势大鼠模型制作成功，同时术后6周随机选取每组大鼠3只连续7 d行阴道细胞学涂片，镜下观察显示涂片的白细胞及炎性细胞增多，上皮细胞以底层细胞为主，无角化细胞，则进一步证实去势大鼠制作成功。各组大鼠骨折前、骨折后2～8周的体质量差异无统计意义(P>0.05)；骨折10周，与假手术组比，其余3组大鼠体质量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠骨折前及骨折后2、4、8和10周的体质量Tab.1 Body mass of rats in each group before and 2, 4, 8 and 10 weeks after fracture

(1)与假手术组比较，P<0.05

2.2 骨痂、骨细胞指数与破骨细胞指数

骨折后，去势组纤维性骨痂和软骨骨痂明显多于假手术组、高剂量组和低剂量组。假手术组骨折后各时点骨细胞指数及破骨细胞指数差异无统计学意义(P>0.05)；骨折后2周时，除假手术组，其余组的骨细胞指数与破骨细胞指数均有不同程度地增高，至4周时达峰值，第8、10周时降低；但与假手术组比较，其余3组骨折后的骨细胞指数与破骨细胞指数均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与去势组比较，低剂量组和高剂量组骨细胞指数与破骨细胞指数均有不同程度地增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与低剂量组比较，高剂量组骨细胞指数与破骨细胞指数均有不同程度地增高，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组大鼠骨折后2、4、8和10周时骨细胞指数与破骨细胞指数个/μm2，n=4)Tab.2 Osteocyte index and osteoclast index at 2, 4, 8 and 10 weeks after fracture in rats of each group

注：(1)与假手术组比较，P<0.05；(2)与去势组比较，P<0.05；F1和P1为4组的骨细胞指数统计值，F2和P2为4组的破骨细胞指数统计值

2.3 骨折周围软组织PDGF、TGF-β和VEGF水平

假手术组骨折2、4、8、10周时骨折周围软组织的PDGF、TGF-β和VEGF差异无统计学意义(P>0.05)。骨折后2周时，除假手术组，其余3组的PDGF、TGF-β和VEGF均有不同程度增高 (P<0.05)，至4周时达峰值，第8～10周降低；与去势组比较，低剂量组和高剂量组的PDGF、TGF-β和VEGF均有不同程度地增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与低剂量组比较，高剂量组的PDGF、TGF-β和VEGF均有不同程度地增高，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图1和表3。

注：A为假手术组，B为去势组，C为低剂量组，D为高剂量组图1 各组大鼠骨折后 2、4、8和10周骨折周围软组织的PDGF、TGF-β和VEGF表达量Fig.1 Expressions of PDGF, TGF-beta and VEGF in soft tissues around fracture at 2, 4, 8 and 10 weeks after fracture in rats of each group

3 讨论

骨质疏松症是多种原因引起的以骨量降低、骨组织微观结构退化为主要病理特征的疾病，可导致骨脆性增高，骨折危险性增加。流行病学统计显示，绝经后骨质疏松症是最常见的原发性骨质疏松症，绝经后女性的患病率接近50%，与同龄非骨质疏松者比，骨质疏松症导致骨折风险增加至少20%[9]。如何改善骨质疏松，降低骨质疏松症导致的骨折发生率及加速骨质疏松骨折的愈合是骨科的研究热点。本研究制备老龄大鼠去势后骨质疏松性骨折模型，给予高、低剂量仙灵骨葆胶囊，结果显示，仙灵骨葆胶囊可能通过调节骨折周围软组织PDGF、TGF-β和VEGF的相对表达量而达到促进骨折愈合的效果。

骨愈合为骨结构强度的重新获得及骨连续性恢复。组织方面，骨折愈合包括血肿炎症机化期、原始骨痂反应期及骨形成改建期。在骨折愈合过程较为复杂，许多因子参与其中，研究较多且较典型的因子有PDGF、TGF-β和VEGF，健康志愿者体内上述因子多为低表达，但在应激条件，上述因子明显增加。PDGF在人体的平滑肌细胞、巨噬细胞及成纤维细胞等均有表达，具有强大的促有丝分裂原的作用，另外，PDGF的趋化作用强，作用在骨折区域的间充质细胞，促进间质细胞的增殖，促进成骨细胞分化，合成Ⅰ型胶原，促进骨折周围软骨细胞增生[10-11]。VEGF与血管新生有明显的相关性，具有促进新生血管形成，改善机体局部供给氧气与营养，当骨折发生时，骨和骨周边软组织遭到破坏，血管断裂，机体反馈性大量分泌VEGF，已发挥VEGF的促血管生成效果。动物研究显示，局部应用 bFGF 及重组PDGF有助于加速骨折愈合[12]。TGF-β是机体内重要的细胞因子，具有多方面的作用，主要体现在促进创伤愈合、改善瘢痕和纤维化。TGF-β可由成骨细胞、破骨细胞及软骨细胞分泌生成，骨组织中，TGF-β一般以无活性的方式存在于骨基质，当骨环境被破坏，如破骨细胞破坏骨基质，TGF-β被激活，立即参与抑制破骨细胞活性，同时诱导成骨细胞的活性，促进骨的修复和愈合，促进TGF-β分泌，即可促进骨折愈合[13-14]。

表3 各组大鼠骨折后2、4、8和10周骨折软组织的PDGF、TGF-β和VEGF表达水平Tab.3 Expression levels of PDGF, TGF-beta and VEGF in soft tissues around fracture at 2, 4, 8 and 10 weeks after fracture in rats of each group

注：(1)假手术组比较，P<0.05；(2)与去势组比较，P<0.05；F1和P1为4组的PDGF统计值，F2和P2为4组的TGF-β统计值，F3和P3为4组的VEGF统计值

仙灵骨葆胶囊是依据苗族民间的经验方研制而制得的现代制剂，以淫羊藿为主药，淫羊藿味甘，性温，归肝肾经，为补肾壮阳、祛风除湿、强筋健骨之要药[15]，配以续断，补骨脂为臣药，知母，丹参，地黄等为佐使药，全方共奏滋补肝肾、活血通络和强筋壮骨等功效，临床主要用于预防和治疗骨质疏松症[16]。本研究结果显示，给予老龄大鼠去势后骨质疏松性骨折大鼠连续灌胃仙灵骨葆胶囊10周，可明显增加骨细胞指数、破骨细胞指数，上调骨折周围组织的PDGF、TGF-β和VEGF的相对表达，提示仙灵骨葆胶囊有助于促进老龄大鼠去势后骨质疏松性骨折愈合，可能与仙灵骨葆胶囊中的有效成分相关。李菲等[17]研究认为淫羊藿苷对慢性脑低灌注时血管新生具有积极的促进作用，该作用与上调受损大脑皮层VEGF信号通路有关；李功营等[18]对大鼠围绝经期给予淫羊藿总黄酮，结果显示淫羊藿总黄酮能升高VEGF水平，从而延缓大鼠围绝经期进程；成魁等[19]认为，与去势组比，淫羊藿苷组大鼠全身与股骨骨密度、股骨生物力学性能差异有统计学意义，提示淫羊藿苷能通过抑制骨吸收而防治骨丢失；宁涛等[20]观察家兔骨折愈合的促进机制，结果显示含有续断的复方续断三七提取物可通过上调家兔外周血的TGF-β水平达到促进骨折愈合的目的；张波等[21]推测续断对骨折的治疗可能是通过调控TGF-β基因在骨愈合不同阶段的表达量促进骨骼生长；魏合伟等[22]研究显示，运用含补骨脂提取物的血清培养的成骨细胞进行移植，可明显增强骨痂中PDGF的表达，促进实验性骨质疏松性骨折的愈合。

综上所述，仙灵骨葆胶囊可促进老龄大鼠去势后骨质疏松性骨折愈合过程，可能与仙灵骨葆胶囊提高骨折周围软组织PDGF、TGF-β和VEGF的相对表达有关。