孙宗斌 王战会 关绍康 郑秋霞 陈虎 朱世杰 段廷贺 张兵兵 刘少朋 许凯

随着生命科学的蓬勃发展,生物医用材料被科研工作者广泛应用于临床医学研究中,一些生物医用材料已经应用于胃肠外科领域,通过在肠道植入支架支撑并扩张肠道解决肠道狭窄问题。Mg-Zn-Y-Nd合金作为一种新型镁合金材料,其具有良好的生物学降解性及生物学安全性［1］。而且,先前研究已经证实PLLA材料涂覆合金表面能够明显延缓合金的降解率［2］。然而,具有良好降解性能的PLLA/Mg-Zn-Y-Nd镁合金肠道支架在肠道内安全性如何尚未见详细报道。本实验以此探究PLLA/Mg-Zn-Y-Nd镁合金支架在兔肠道内的安全性。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源 选取6月龄健康新西兰大白兔36只,体质量2.0～2.5 kg,健康状况良好。随机分为空白对照组、裸支架组、PLLA涂层组,各12只。可降解Mg-Zn-Y-Nd合金材料由郑州大学河南省先进镁合金重点实验室提供,采用单丝一体化整体性编织技术制备支架,经浸涂提拉法涂覆PLLA,制备出裸露Mg-Zn-Y-Nd合金支架12枚,PLLA/Mg-Zn-Y-Nd 支架12枚。支架大小20.0 mm ×10.0 mm,纤维直径0.30 mm。

1.2 实验方法 36只大白兔植入支架时经肌内注射戊巴比妥麻醉,麻醉后剃除腹部兔毛,常规进行消毒,沿腹中线逐层切开皮肤以暴露腹腔,寻找结肠,于植入部位上缘纵行切开一小口,切口0.8 cm,将支架植入结肠部位。支架固定后腹腔行抗感染处理,妥善缝合切口。

将植入白兔内的支架分别在不同时间观察点(2、5、8 d)取出,并在取出之前对每只兔子进行X线拍照。取支架周围肠道组织和心脏及肝脏器官,以10%福尔马林溶液固定24 h,石蜡包埋,3～5 μm连续切片制作石蜡切片,心脏及肝脏仅作苏木精-伊红染色法(HE染色)处理,肠道组织石蜡切片在Bcl-2抗体(以1∶200稀释)及Bax抗体(以1∶200稀释)中孵育。并使用免疫组化技术进行检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用方差分析；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 影像学分析 图1a显示肠内明亮、高密度的网状圆柱形管,这是镁合金肠内支架的X线显影。图1b显示PLLA涂层的Mg-Zn-Y-Nd合金肠支架植入5 d后的X线显影强度较植入2 d的肠道支架弱。图1c显示支架植入肠内8 d时的X线显影未被发现。实验期间,未发现其他脏器损伤及穿孔、梗阻现象。

2.2 HE染色分析 术后第2天、第5天的肝脏组织形态,从图片可见术后第2天肝细胞核结构无明显异常,有少量炎性细胞浸润到细胞间质,肝结构形态无异常。术后第5天炎症细胞浸润较前减少,肝结构形态无异常。见图2a、b。术后第2天、第5天的肾脏组织形态,而肾小球和肾小管形态无明显异常,少量炎症细胞渗出。术后5天肾脏组织炎症细胞明显减少。见图2c、d。

2.3 免疫组化分析 术后2 d,PLLA涂层组Bax表达水平(17.3±1.6)%略高于空白对照组(17.0±1.3)%。裸支架组Bax表达水平(18.3±2.6)%略高于空白对照组,且裸支架组Bax表达水平稍高于PLLA涂层组。术后5 d,PLLA涂层组Bax表达水平(17.1±1.0)%较术后2 d稍降低,同时略高于空白对照组(16.6±1.2)%。但随着时间推移,裸支架组Bax的表达水平始终略高于PLLA涂层组和空白对照组。在Bcl-2的表达方面,随着支架植入时间延长,第5天PLLA涂层组表达水平(14.7±1.3)%较第2天(15.2±1.0)%稍降低,而且PLLA涂层组的Bcl-2表达水平在整个实验期间均略低于裸支架组和稍高于空白对照组。但裸支架组与空白对照组之间Bcl-2表达水平在实验期间比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。术后2、5 d后,不同组间Bax和Bcl-2的表达水平比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。见图3。

图1 PLLA/Mg-Zn-Y-Nd合金肠道支架植入新西兰大白兔体内不同时间X线片

图2 健康家兔肠内植入PLLA/Mg-Zn-Y-Nd合金支架后重要器官的病理学图像

图3 支架周围肠道组织免疫组化结果

3 讨论

肠道狭窄是一种常见的外科疾病,也是一些疾病或外科手术的并发症。肠道支架不仅用于治疗恶性肠狭窄,如结肠癌梗阻,而且适用于肠道的良性肠狭窄,例如结肠瘘、吻合口瘘、穿孔、炎性狭窄等［3-8］。目前,治疗肠狭窄的支架包括自膨胀金属支架、自膨胀塑料支架和生物可降解支 架［9,10］。然而,关于PLLA/Mg-Zn-Y-Nd镁合金肠道支架的安全性研究尚未见详细报道。

在本研究中,X线片提示,随着植入时间的延长,支架在兔肠道环境的影响下逐渐降解。透过显影还可以看到,未发现其他脏器损伤及穿孔、梗阻现象。待PLLA/Mg-Zn-Y-Nd合金支架植入兔体内后,可以发现肝脏及肾脏组织的病理图片均未见明显异常。提示PLLA/Mg-Zn-Y-Nd合金支架植入动物体内后并不能明显引起机体系统炎症反应,而且免疫组化实验结果表明PLLA/Mg-Zn-Y-Nd合金支架降解产物对肠道组织细胞(尤其上皮细胞)的增殖无明显诱导作用(P＞0.05)。这一结果表明PLLA/Mg-Zn-Y-Nd合金支架的短期植入并不利于引起肠道上皮细胞的内皮化。有参考文献［11］报道称,AM50和WE43铸造镁合金对人脐静脉血管内皮细胞增殖及生长无明显影响,具有良好的细胞相容性。

综上所述,PLLA/Mg-Zn-Y-Nd肠道支架被植入新西兰大白兔肠道内后,未见引起其他脏器损伤及穿孔、梗阻现象,而且对肠道上皮细胞增殖无明显促进作用,该支架具有良好的生物学安全性。