闫 波，袁丽萍，张 琴，华 冉，李玉飞，戴寒晶

(1.安徽医学高等专科学校医学技术系;2.安徽医科大学第一附属医院儿科,安徽 合肥 230000)

过敏性紫癜(Henoch-Schonlein syndrome, HSP)是儿童时期最常见的一种系统性小血管炎综合征，其病理生理机制为IgA1免疫复合物沉积在血管壁导致血管内皮细胞损伤、功能屏障为主的全身免疫性小血管炎症[1]。炎症伴随着组织酸化，我们前期研究证实HSP患儿皮肤血管内皮中存在ASIC1a的高表达，ASICs阻断剂Amiloride可以显著抑制HSP患儿血管内皮细胞细胞因子的分泌，改善血管内皮细胞的损伤[2-3]。本研究在血管内皮细胞中靶向沉默ASIC1a，观察其对HSP患儿血管内皮细胞细胞因子、骨架蛋白的影响，进一步探讨HSP血管炎发生的分子机制。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1细胞株及试剂人皮肤微血管内皮细胞HDMVEC 购自美国ATCC公司，重组穿梭质粒和包装质粒 pGag/Pol、 pRev、 pVSV-G 由上海吉玛制药技术有限公司构建制备， ECM 细胞培养基、胎牛血清(FBS)、胰酶购自美国Hyclone公司，Lipofectamine 2000转染试剂、TRIzol及M-MLV 反转录试剂盒均为美国Invitrogen公司产品。

1.1.2HSP患儿及正常儿童IgA1的分离收集6例HSP患儿(6～13岁，男3例，女3例)及6例正常健康同龄儿童血清，参照文献[3]采用Jacalin 亲和层析法及蛋白纯化法提取血清IgA1。

1.1.3慢病毒siRNA表达载体的构建及重组慢病毒包装根据ASIC1a(NM_020039)的RNA 序列信息，由上海吉玛制药技术有限公司按RNA干扰序列设计针对序列的si-RNA，根据ASIC1a序列(5' -GCCAAGAAGT TCAACAAATCT-3' )设计并合成2条互补的、编码shRNA的DNA单链，退火后连接到慢病毒载体pshRNA。合成好的互补双链克隆至表达载体pshRNA，一组 siRNA 序列的错义序列(5' -TTCTCCGAACGTGTCACG T-3' )作为阴性对照，构建阴性对照载体。重组克隆经测序后进行无内毒素质粒DNA 提取，提取过程严格按照试剂盒说明书进行，重组质粒分别命名为pshRNA-ASIC1a、pshRNA-NC。

重组慢病毒制备:采用293 T细胞制备重组慢病毒， 取对数生长期细胞， 胰酶消化并计数后，取2×106个细胞接种于10 cm 培养皿，加入含 10%FBS的DMEM培养基10 mL，37 ℃、5%CO2条件下培养过夜。在5 mL离心管中加入1.5 mL无血清DMEM，加入含目的序列的穿梭质粒和包装质粒(pGag/Pol、 pRev、 pVSV-G)，混匀；在另一支5 mL离心管中加入1.5 mL无血清 DMEM， 再加入300 μL RNAi-Mate，混匀，室温放置 5 min后将两管混合，室温放置 20～25 min。待细胞80%～90%融合时，按照 Lipofectmaine 2000转染试剂说明书进行操作。转染后72 h， 收集细胞上清液， 用 0.45 μm过滤器过滤按照梯度稀释法测定滴度，- 80 ℃冰箱保存。2组病毒分别命名为LV3-NC 和LV3-sh-ASIC1a。

1.1.4HDMVEC细胞的培养及分组HDMVEC 细胞培养在含 10%胎牛血清， 100 U·mL-1青霉素，100 μg·mL-1链霉素的ECM 培养基中，37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。当细胞长至 80%～90%时，去除培养基，加入PBS 洗 1～2 次，去除PBS后，加入1 mL胰酶消化 1～3 min 后，加入3 mL完全培养基中和胰酶终止消化，将消化的细胞转移至 15 mL离心管中，1 000 rpm 离心 5 min。倒掉上清加入3 mL培养基重悬细胞，1∶3 传代至培养皿中培养。

取对数生长期的细胞进行转染，将细胞分为无病毒转染对照组(NC组)、LV-h-ASIC1a转染组(si-ASIC1a组)。 转染前1 d，接种 HDMVEC 细胞到6 孔板，每孔 5×105细胞，37 ℃、5% CO2过夜，进行病毒转染，12～24 h移去细胞侵染后的病毒液，加入细胞培养液继续培养，感染 72 h 后，荧光显微镜下观察细胞转染情况，RT-PCR法测定转入基因ASIC1a的表达。

将细胞分为NC组， NC+正常健康儿童血清IgA1 (NC+ serum) 组，NC+HSP患儿血清IgA1 (NC+ HSP) 组，si-ASIC1a组，si-ASIC1a+正常健康儿童血清IgA1 (si-ASIC1a+ serum) 组，si-ASIC1a+HSP患儿血清IgA1 (si-ASIC1a+ HSP) 组，在转染后的细胞中加入正常儿童或HSP患儿血清IgA1 (250 μg·mL-1)培养12 h，用无血清细胞培养液培养6 h，收集细胞上清，ELISA法测定其上清中TNF-α、IL-8水平；收集细胞，real-time PCR和 Western blotting 分别检测细胞骨架蛋白(SM-α, Destrin, Vinculin, ML-CK)mRNA及蛋白表达水平。

1.1.5Real-timePCR测定ASIC1a及细胞骨架蛋白SM-α,Destrin,Vinculin,ML-CKmRNA表达收集好的细胞按照Trizol法提取总RNA，按照试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，后进行荧光定量PCR扩增，ASIC1a引物：F-GAGATACCAGACACACAGATGG，R-CACGCATGTTGAAGGGTTTG(扩增长度:100 bp)；SM-α引物：F-AGGGAGTGATGGTTGGAATG，R-GATGATGCCGTGTTCTATCG(扩增长度:200 bp)；destrin引物：F-GTAAATGCTCCACACCAGAAGA，R-CACCAACATCTCCAA CCAAGA(扩增长度:123 bp)；Vinculin引物：F-GAACATCAGACCTGCTCCTTAC，R-TTCCATAGTCTCCACCACCT(扩增长度:113 bp)；MLCK引物：F-GCTGCCT GACCACGAATATAA，R-CATCTGACACCTCCACTTCATC(扩增长度:137 bp)；GAPDH引物：F-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC，R-AGTAGAGGCAGGGATGATGT(扩增长度:133 bp)。荧光定量PCR反应体系包括cDNA 2 μL，PCR上游及下游引物(10 μm)0.4 μL，SYBR Green solution 10 μL，ddH2O 7.2 μL，总体积20 μL，置于PCR仪中，反应条件为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，40个循环。95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，溶解曲线。根据 CT值算出 2-△△ct， -△△ct=N目的-N内参-T目的+T内参(N目的=正常组目的基因，N内参=正常组内参基因，T代表是实验组)，然后各组间用 2-△△ct结果进行比较。

1.1.6Westernblotting检测细胞骨架蛋白SM-α,Destrin,Vinculin,ML-CK蛋白表达收集好的细胞加入500 μL RIPA 裂解液提取蛋白(每1 000 μL RIPA 中加入10 μL PMSF)，按照BCA 测定试剂盒测定提取蛋白的浓度，将蛋白加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，后将蛋白转移至PVDF膜上，将膜移至含有封闭液(5%脱脂奶粉TBST 溶液)的平皿中封闭1 h，然后与1∶1 000兔抗人多克隆抗体SM-α、destrin、Vinculin、MLCK于4 ℃孵育过夜，再与HRP标记的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG(1∶5 000)室温孵育 2 h，采用 Thermo ECL 进行化学发光显色，结果测定用Quantity One软件分析。

2 结 果

2.1HDMVEC细胞慢病毒转染荧光显微镜结果显示HDMVEC细胞72 h基因转染率为100%，如图1。RT-PCR结果显示病毒转染72 h后，与NC组比较， ASIC1a转染组(si-ASIC1a组)细胞内ASIC1a mRNA表达明显降低(P<0.01)，如图2。

2.2ASIC1a沉默对HSP血清IgA1诱导HDMVEC细胞表达TNF-α和IL-8的影响与NC对照组及NC+ serum组比较，NC+HSP组HDMVEC细胞培养上清中TNF-α和IL-8水平显著增加，si-ASIC1a、si-ASIC1a+正常血清IgA1(si-ASIC1a+serum)、si-ASIC1a+HSP血清IgA1(si-ASIC1a+HSP)组细胞培养上清中TNF-α和IL-8水平明显下降(P<0.01); 与NC+HSP组比较，si-ASIC1a+HSP组细胞培养上清中TNF-α和IL-8水平亦显著降低(P<0.01)，提示ASIC1a沉默可以显著抑制HDMVEC细胞炎性细胞因子的分泌。如图3。

图1 HDMVEC细胞病毒转染效率

注：与NC组比较P<0.01。

2.3ASIC1a沉默对HSP血清IgA1诱导HDMVEC细胞骨架蛋白表达的影响与NC对照组比较，HSP血清IgA1可以降低HDMVEC细胞骨架蛋白SM-α、destrin、Vinculin、MLCK mRNA(图4)和蛋白的表达(图5) (P<0.01)；沉默HDMVEC细胞ASIC1a，细胞骨架蛋白mRNA(图4)及蛋白表达明显增加(图5) (P<0.01)；HSP血清IgA1对沉默ASIC1a的HDMVEC细胞，其细胞骨架骨架蛋白mRNA(图4)及蛋白表达明显增加(图5) (P<0.01)，但与si-ASIC1a细胞组比较，其细胞骨架骨架蛋白mRNA(图4)及蛋白表达降低(图5) (P<0.01)。

注：与NC组比较**P<0.01；与si-RNA组比较##P<0.01；与NC+HSP组比较▲▲P<0.01。

图3ASIC1a沉默对HSP患儿血清IgA1诱导细胞表达TNF-α和IL-8的影响(n=6)

注：与NC组比较**P<0.01；与si-RNA组比较##P<0.01；与NC+HSP组比较▲▲P<0.01。

注：与NC组比较**P<0.01；与si-RNA组比较##P<0.01；与NC+HSP组比较▲▲P<0.01。

3 讨 论

ASICs是一类由胞外H+激活的阳离子通道，在某些病理反应如局部缺血、炎症、癫痫等过程中发挥重要作用，在这些病理反应中共同的特点是组织酸化，激活的ASICs 导致胞外Na+、 Ca2+内流并激发各种病理生理效应[4]。研究证实在HSP发生发展过程中， IgA形成的循环免疫复合物，尤其是IgA1作用于HSP患儿血管内皮细胞，导致血管内皮细胞损伤，促使血小板的激活，并释放IL-8、 NO、 TM等血管活性物质，形成微血栓，加重局部缺血，乳酸等酸性代谢产物增多，引起局部pH下降[5]。我们研究发现HSP患儿局部组织酸化可以激活其皮肤血管内皮细胞中ASIC1a及ASIC3表达[6]；体外研究发现HSP血清IgA1可以刺激细胞外酸化的人皮肤微血管内皮细胞(HDMVEC)中 ASIC1a、 ASIC3 mRNA 及蛋白表达，抑酸剂奥美拉唑及西米替丁可以明显促进 HSP 患儿皮疹消退[7]，提示 ASICs 可能对 HSP 患儿血管损伤发挥一定的调控作用。

RNAi技术是通过特异性剔除或关闭特定基因的表达探索该基因的功能，本研究中我们把ASIC1a基因的siRNA序列转染入HDMVEC细胞中进行ASIC1a基因沉默，发现转染ASIC1a基因siRNA后，HDMVEC细胞ASIC1amRNA表达明显低于空质粒转染 (NC) 组，说明基因沉默成功。本研究中我们发现转染ASIC1a基因siRNA可以抑制HSP患儿血清IgA1刺激后的HDMVEC细胞TNF-α及IL-8分泌。既往研究已经明确在HSP急性期其体内TNF-α和IL-8增加，这些炎症细胞因子增加促进了血管炎的发生，参与了HSP的发生及发展[8]。我们研究亦发现HSP患儿血清IgA1与HDMVEC细胞共培养，细胞培养上清中TNF-α和IL-8水平明显增加，ASIC1a基因siRNA转染HDMVEC与HSP患儿血清IgA1共培养，培养上清中TNF-α和IL-8水平显著下降，说明沉默ASIC1a可以抑制或减轻HSP患儿体内IgA1沉积介导的血管炎的发生。

为进一步探讨ASIC1a在HSP患儿血管内皮细胞损伤中的作用，我们测定了转染后HDMVEC细胞骨架蛋白SM-α、destrin、Vinculin、MLCK mRNA和蛋白表达。研究发现酸化的细胞外环境导致血管内皮细胞行为的改变，从而引起细胞骨架蛋白的改变，致使血管损伤和功能丧失[9]。本研究发现HSP患儿血清IgA1可以抑制HDMVEC细胞骨架蛋白SM-α、destrin、Vinculin、MLCK mRNA和蛋白表达，HSP患儿血清IgA1和ASIC1a基因siRNA转染HDMVEC共培养可以促进SM-α、destrin、Vinculin、MLCK mRNA和蛋白表达，提示沉默ASIC1a基因siRNA可以保护HSP患儿血管内皮炎症性损伤。

综上，ASIC1a在HSP血管炎发生发展过程中发挥重要的调节作用，沉默ASIC1a可以改善HSP患儿血管内皮细胞损伤，ASIC1a是一个颇具潜力的基因治疗靶点。