付启云 郑绍同 连建春 戴京京 张小云

(南京医科大学附属淮安第一医院医学检验中心，淮安 223300)

多年来，鲍曼不动杆菌一直是我国医院临床最常见分离到的菌种之一，该菌对抗菌药物的耐药性也持续保持高位。根据我国全国细菌耐药监测网(CARSS)的2014—2016年3年度全国性耐药监测报告显示，鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物的耐药率远高于铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌。鲍曼不动杆菌耐药问题已经十分严重，国内(广州与杭州)[1-4]与国外[5-8]近年均有极度耐药的鲍曼不动杆菌菌株报道[2-8]。多年来，国内关于鲍曼不动杆菌的耐药元件基因研究屡有报道，但尚无在同一家医院对相隔多年的鲍曼不动杆菌临床分离株进行耐药元件基因检测与分析报道。本文收集了南京医科大学附属淮安第一医院的相隔7年的鲍曼不动杆菌菌株，对其耐药元件基因进行了检测，现报告与分析如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源与菌种鉴定

耐药鲍曼不动杆菌不同年份分离株收集分离自南京医科大学附属淮安第一医院。分别为2008年20株，2016年20株。本研究中2008年分离株菌株号为1-20；2016年分离株菌株号为21-40。菌种鉴定为鲍曼不动杆菌种特异mdfA基因与blaOXA-51基因(该基因在不动杆菌属菌中仅鲍曼不动杆菌拥有)PCR双重检测为阳性方确认为鲍曼不动杆菌。

1.2 抗菌药物药敏试验

VITEK2-Compact全自动分析仪仪器法和K-B纸片法双重检测。

1.3 菌体DNA提取

鲍曼不动杆菌菌株DNA提取为蛋白酶K溶液56℃消化法，经100℃ 10min灭活蛋白酶K后即用作耐药元件基因检测。

1.4 耐药元件基因检测

耐药元件基因检测为PCR法。检测项目见表1，引物序列由无锡新吴区新克隆数据分析工作室提供。PCR扩增试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。

1.5 菌株亲缘关系分析

耐药元件基因测得结果作UPGMA法样本聚类分析(由无锡新吴区新克隆数据分析工作室完成)，进而了解菌株间的亲缘关系。

表1 耐药鲍曼不动杆菌耐药元件基因检测项目Tab.1 Resistant determinants in drug-resistant Acinetobacter baumannii

2 结果

2.1 药敏试验结果

耐药鲍曼不动杆菌2008和2016年不同年份分离株药敏试验检测结果及百分率(%)见表2。

2.2 耐药元件基因结果

2008和2016年不同年份分离株均检出blaADC、blaOXA-51，但blaOXA-2群、blaOXA-23群、aac(2')-Ⅰb、aph(3')-Ⅰ、armA、tnpU、tnp513、IS26和ISaba1等9种只有2016年的分离株被测出。不同年份分离株检测结果及百分率(%)见表3。

2.3 菌株亲缘关系分析

2008和2016年不同年份分离株耐药元件基因检测结果的样本聚类分析见图1。由树状图可见，2008和2016年不同年份分离株成两个独立的簇群，2016年分离株聚集性更强相差系数更小(即菌株更接近)。

2.4 耐药元件基因检测结果阳性模式

耐药鲍曼不动杆菌不同年份分离株耐药元件检测阳性模式及占比百分率见表4。

表2 耐药鲍曼不动杆菌不同年份分离株药敏试验检测结果及百分率Tab.2 Resistant rates of drug-resistant Acinetobacter baumannii to antimicrobial agents isolated from different years

3 讨论

尽管鲍曼不动杆菌仅为条件致病菌，但由于该菌有极强的生物膜生成能力[8]，因而常常导致住院重症患者呼吸机相关肺炎和导管相关血行感染，最终导致患者死亡。

国内鲍曼不动杆菌耐药问题严重，近年来，关于鲍曼不动杆菌的耐药元件基因或全基因组研究国内屡有报道[9-15]，在同一家医院对相隔7年的鲍曼不动杆菌临床分离株进行耐药元件基因检测与分析尚无报道。

本研究收集相隔7年的鲍曼不动杆菌临床分离株进行耐药元件基因检测，由表2药敏试验检测结果可见，2016年分离株对第三代头孢类药物、碳青霉烯类药物、氨基糖苷类药物、喹诺酮药物均为耐药，因此属于泛耐药菌株。2008年分离株仅对第三代头孢类药物耐药，而对碳青霉烯类药物敏感，对喹诺酮药物、氨基糖苷类药物分别有50.00%和60.00%的敏感性，所以2008年分离株仅为多重耐药菌株。

表3 耐药鲍曼不动杆菌不同年份分离株耐药元件基因检测结果及百分率Tab.3 Positive rates of resistance determinants in drug-resistant Acinetobacter baumannii isolated from different years

图1 2008年和2016年不同年份分离株耐药元件基因检测结果的样本聚类分析Fig.1 Sample cluster analysis of drug resistance element gene detection results of isolates from different years of 2008 and 2016

表4 耐药鲍曼不动杆菌不同年份分离株耐药元件检测阳性模式及百分率Tab.4 Positive modes of resistance determinants in drug-resistant Acinetobacter baumannii isolated from different years

本文不同年份分离株耐药元件检测显示(表3)，2008年和2016年分离株均检出blaADC、blaOXA-51，但blaOXA-2群、blaOXA-23群只有2016年分离株均被检出。β-内酰胺酶基因blaOXA-51其表达产物无碳青霉烯类药物水解活性,但鲍曼不动杆菌中均存在blaOXA-51基因(位于染色体上)所以被用作菌种鉴定，以区分于同属的其它不动杆菌。本文2008年分离株对第三代头孢类药物耐药主要与blaADC相关，2016年分离株对第三代头孢类药物、碳青霉烯类药物耐药主要与blaADC、blaOXA-2群和blaOXA-23群相关。2016年分离株均测出aac(2')-Ⅰb、aph(3')-Ⅰ、armA等3种氨基糖苷类药物耐药相关基因，而2008分离株均无检出，故2016年分离株对氨基糖苷类药物高耐药性的遗传背景明确。可移动遗传元件遗传标记tnpU、tnp513、IS26、ISaba1等4种也只有2016年分离株被全部检出。可移动遗传元件是获得性耐药基因的载体，ISaba1可与blaOXA-23连锁[9]。转座子和插入序列等组成的可移动遗传元件是获得性耐药基因快速传播的原因。

本文的菌株亲缘关系分析，由图1可见，2008年和2016年不同年份分离株分成两个独立的簇群(A簇群和B簇群)，2016年分离株聚集性更强，相差系数更小(即菌株更接近)。A和B簇群均可分为两个亚簇群。A-1亚簇群有两个克隆播散，A-2、B-1、B2亚簇群各有一个克隆播散。其中2016年分离株B-簇群一个有14株菌构成的大克隆播散。

本文耐药鲍曼不动杆菌不同年份分离株耐药元件检测阳性模式显示(表4)，2008年分离株仅携带2种～7种耐药元件基因；2016年分离株则携带14～16种耐药元件基因。不同年份分离株耐药元件基因携带状况差异明显。