莫梢梢 刘宝 胡智成 万珊 费樱,,*

(1 贵州医科大学医学检验学院，贵阳 550004；2 贵州医科大学附属医院 微生物免疫科，贵阳 550004)

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, Kpn)是革兰阴性肠杆菌科细菌，可引起下呼吸道、泌尿道及消化道等多部位感染，是临床分离及院内感染最常见的致病菌之一[1]。超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum beta-lactamases, ESBLs)能够水解几乎所有β-内酰胺酶抗生素，是Kpn出现多重耐药的重要原因[2]。可移动遗传元件(mobile genetic elements, MGEs)是ESBLs基因等多种耐药基因的载体，可通过细菌接合、转化、转导等方式捕获耐药基因，并整合到自身基因组中，使受体菌出现相应的耐药表型，从而出现多重耐药现象，是医院感染病原菌常见的耐药机制[3]。国内外有文献报道，肺炎克雷伯菌的多重耐药性与可移动遗传元件有关[4-8]。产ESBLs Kpn表现为多重耐药是否与其可移动遗传元件的存在有关，本地区报道较少。为了了解本地区产ESBLs Kpn的ESBLs基因及可移动遗传元件标记基因携带情况及其相关性，本研究分别对产与非产ESBLs Kpn中4种ESBLs基因、8种MGEs标记基因进行检测分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

产和非产ESBLs Kpn非重复菌株(鉴定率为95%以上)各100株，来源于2017年7—10月我院的住院患者。

质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853和肺炎克雷伯菌ATCC700603，购自贵州省临床检验中心。

1.2 主要仪器和试剂

MicroScan WalkAway 96 plus全自动细菌鉴定与药敏分析仪(美国Beckman Coulter公司)；ProFlex型PCR仪(美国ABI公司)；GenoSens1500凝胶成像仪(上海Clinx公司)；DYY-6C电泳仪(北京市六一仪器厂)；细菌基因组DNA提取试剂盒与高纯度质粒小提中量试剂盒(北京天根生化科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 菌株鉴定、耐药表型确认及药敏试验

按照《全国临床检验操作规程》(3版)[9]要求进行细菌分离培养，采用全自动细菌鉴定与药敏分析仪进行菌株鉴定、耐药表型确认及药敏试验，并参照美国食品和药品管理局(FDA)标准进行结果判读。产ESBLs的Kpn为产ESBLs Kpn，既不产ESBLs、也不是耐碳青霉烯类的Kpn为非产ESBLs Kpn。

1.3.2 DNA提取

采用试剂盒分别进行细菌基因组及质粒DNA提取。

1.3.3 目的基因检测

根据NCBI中已发布的目的基因序列设计合成引物，见表1。在细菌扩大培养的LB液体培养基中未加细菌，培养条件及DNA提取过程均同Kpn标本，得到的液体则作为阴性对照。采用PCR法检测目的基因，其反应体系为：ddH2O 9.5µL、模板DNA 1µL、10µmol/L的上、下游引物各1µL、PremixTaq酶12.5µL，总体积为25µL，基因的扩增条件见表2。基因扩增产物在2.0%琼脂凝胶中150V电泳30min后于凝胶成像仪下观察并保存结果。随机抽取每个目的基因PCR阳性产物3株进行测序，测序结果作Blast比对。

1.4 统计分析

统计软件使用SPSS 21.0，计数资料的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义；ESBLs基因与MGEs标记基因检测结果的相关性研究，采用指标聚类分析法。

2 结果

2.1 目的基因检测

产ESBLs Kpn中，ESBLs基因阳性率高达100%，基因型以blaSHV-12、blaTEM-1和blaCTX-M-125为主；MGEs标记基因以IS26、ISEcp1、traA、trbC和intI1为主，阳性率均高于非产ESBLs Kpn的阳性率(P＜0.05)。此外，产ESBLs Kpn中，同时检出ESBLs基因与MGEs标记基因的检出率明显高于非产ESBLs Kpn的检出率(P＜0.05)；产与非产ESBLs Kpn中均没有只检出MGEs标记基因的菌株。产与非产ESBLs Kpn目的基因携带情况详见表3～4，部分基因扩增产物电泳结果见图1。

2.2 序列比对

基因测序结果作BLAST比对，相似性均大于95%，见图2。

2.3 指标聚类分析

指标聚类分析结果显示，产ESBLs Kpn中基因blaSHV-12、blaOXA-1与MGEs基因tnpU、tnp513、merA、intI1相关联，基因blaTEM-1、blaCTX-M-125与MGEs基因ISEcp1、IS26、traA相关联，见图3～4；非产ESBLs Kpn中ESBLs基因与MGEs标记基因相关性不明显，见图5～6。

表1 PCR引物序列Tab.1 The primers used in PCR

表2 扩增基因的PCR反应条件Tab.2 PCR reaction condition of DNA amplification

表3 产ESBLs Kpn与非产ESBLs Kpn目的基因检测阳性率(%)Tab.3 Positive rate of target genes in ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae and non-ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae (%)

表4 产ESBLs Kpn与非产ESBLs Kpn目的基因的检出率Tab.4 Detection rate of target genes in ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae and non-ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae

3 讨论

图1 blaSHV-12基因PCR电泳图Fig.1 The PCR electrophoretogram of blaSHV-12 gene

图2 blaSHV-12基因测序结果比对图Fig.2 The comparison chart of sequencing results of blaSHV-12 gene

ESBLs是由质粒编码的β-内酰胺酶，能够水解青霉素、氨曲南及第一、二、三代头孢菌素等抗生素，从而使Kpn出现多重耐药。本研究中，产ESBLs Kpn ESBLs基因阳性率高达100%，基因型以blaSHV-12、blaTEM-1和blaCTX-M-125为主，提示我院产ESBLs Kpn ESBLs基因携带率高，以blaSHV、blaTEM和blaCTX-M型产ESBLs Kpn多见，与汪琴琴等[10-12]学者报道一致。

接合性质粒主要有traA基因和trbC基因两个遗传标记，它们分别编码细菌性菌毛，是细菌接合必备的部件。转座子和插入序列属于转座因子，是一类在细菌染色体、质粒或噬菌体之间自行移动并具有转位特性的DNA，可以使遗传物质优化组合，积累有意义的遗传信息，使细菌获得一种新的适应能力。整合子则位于细菌的质粒或染色体上，具有位点特异性重组功能，能捕获及整合外源耐药基因，从而导致耐药性的产生和播散。这3类MGEs能捕获多种外源性耐药基因，与细菌多重耐药相关。有文献报道，Kpn中MGEs的常见标记基因有traA、trbC、merA、tnpU、tnp513、ISEcp1、IS26和intI1基因[13-17]。为此，本研究探讨了产与非产ESBLs Kpn中这8类MGEs标记基因与常见的ESBLs基因携带情况。结果显示，产ESBLs Kpn携带的MGEs标记基因以IS26、ISEcp1、traA、trbC和intI1基因为主，阳性率均明显比非产ESBLs Kpn的高；同时检出ESBLs基因与MGEs标记基因的检出率明显高于非产ESBLs Kpn的检出率，提示产ESBLs Kpn ESBLs基因携带率高、出现多重耐药，可能与MGEs的携带率高、获得多种外源性耐药基因可能性大有关。此外，产与非产ESBLs Kpn中均没有只检出MGEs标记基因的菌株，提示MGEs标记基因在Kpn中可能不是单独存在的。为进一步了解产ESBLs Kpn携带的ESBLs基因与MGEs标记基因的相关性，本研究对产与非产ESBLs Kpn目的基因检测结果分别作了指标聚类分析，结果提示，产ESBLs Kpn中基因blaSHV-12、blaOXA-1与MGEs标记基因tnpU、tnp513、merA、intI1相关联，基因blaTEM-1、blaCTX-M-125与MGEs标记基因ISEcp1、IS26、traA相关联；非产ESBLs Kpn中ESBLs基因与MGEs标记基因相关性不明显，提示产ESBLs Kpn携带的ESBLs基因与MGEs标记基因存在相关性，可能是产ESBLs Kpn出现多重耐药的重要原因，与文献报道一致[18-21]。

图3 产ESBLs Kpn ESBLs基因与MGEs标记基因检测结果的指标聚类分析(基因组)Fig.3 The index cluster analysis for the detection results of ESBLs genes and genetic markers of MGEs in ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae (Genome)

图4 产 ESBLs Kpn ESBLs基因与MGEs标记基因检测结果的指标聚类分析(质粒)Fig.4 The index cluster analysis for the detection results of ESBLs genes and genetic markers of MGEs in ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae (Plasmid)

图5 非产 ESBLs Kpn ESBLs基因与MGEs标记基因检测结果的指标聚类分析(基因组)Fig.5 The index cluster analysis for the detection results of ESBLs genes and genetic markers of MGEs in non-ESBLsproducing Klebsiella pneumoniae (Genome)

图6 非产 ESBLs Kpn ESBLs基因与MGEs标记基因检测结果的指标聚类分析(质粒)Fig.6 The index cluster analysis for the detection results of ESBLs genes and genetic markers of MGEs in non-ESBLsproducing Klebsiella pneumoniae (Plasmid)

综上所述， 产ESBLs Kpn ESBLs基因和MGEs标记基因携带率高，两者存在相关性，可能是产ESBLs Kpn出现多重耐药的重要原因；MGEs标记基因在Kpn中可能不是单独存在的。