吴建丽，王鲁豫，张 强，孙云梦

(黄河科技学院 医学院，河南 郑州 450000)

地锦草是药用价值很高的植物，研究报道地锦草化学成分多达十几种，主要有多糖、黄酮、甾体苷等[1]。故其药理作用也非常多，如：止血、保肝、抗氧化等[2-3]。多糖是一种广泛存在于自然界生物体的天然功能性高分子化合物，具有抗氧化、抗病毒、抗辐射、等多种生理活性，因此研究天然产物中多糖的提取工艺对资源的开发与利用意义重大。响应面方法[4-6]是利用合理的实验设计并通过试验得到一定的数据，采用多元二次方程的分析来寻求最优化工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。本文在前期工作[7]的基础上，就提取中影响多糖得率的几个重要因素做了系统研究，并用响应面分析法对地锦草多糖的提取条件进行了优化。用Box-Behnken的中心组合试验设计，对试验数据进行分析，对拟合数学模型进行了较为相继的描述，得到了地锦草多糖提取的最佳工艺参数，以期为地锦草多糖的开发与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

地锦草：采自黄河科技学院周边野地，洗净，晒干，粉碎，过100目筛，备用；葡萄糖标准品、苯酚、浓硫酸、甲醇、乙醇：分析纯；石油醚(沸点60～90℃)；5%苯酚，自制；纯化水。

1.2 仪器与设备

FA1004型电子天平：上海良平仪表有限公司；HK-10B500g型摇摆式粉碎机：广州市旭朗机械设备有限公司；TL80-1型医用离心机：中国姜堰市天力医疗器械有限公司；JH7230G型可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；WBFY-201型微波反应器:上海丞明仪器设备有限公司生产。

1.3 方法

1.3.1 地锦草多糖提取的工艺流程

(1)地锦草石油醚脱脂，甲醇脱色；(3)按照一定的浸泡时间，微波功率，微波时间，液料比进行提取；(4)提取液离心，收集上清液，回流浓缩，冷却；(5)浓缩液4 ℃静置12 h醇沉，3000 r/min离心20 min，弃上清液；(6)转移至100 mL 容量瓶中，纯化水定容。(7)配置空白溶液，在490 nm处校正仪器并测量吸光度。

1.3.2 多糖含量的测定

1.3.2.1 标准曲线的绘制

配制0、10、20、30、40、50、60μg/mL的葡萄糖系列标准溶液。用苯酚-硫酸法490 nm处测定吸光度。以葡萄糖浓度(μg/mL)横坐标，吸光值为纵坐标作图，求得回归方程为y=0.011x+0.0188，R2=0.9992。

1.3.2.2 地锦草多糖含量的测定

测定地锦草提取液中多糖的吸光度值，代入回归方程计算多糖浓度，根据公式计算：多糖得率(mg/g)=c×V×n/W。式中：c为提取液多糖浓度，mg/mL；V为多糖提取液的体积，mL；n为稀释倍数；W为地锦草粉末质量，g。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 液料比对地锦草多糖得率的影响

称取1.000 0 g地锦草5份，液料比分别为30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1 mL/g，加入纯化水，设定浸泡时间为60 min，微波时间为40 s，微波功率为240 W。

1.3.3.2 微波时间对地锦草多糖得率的影响

称取1.000 0 g地锦草5份，设定微波时间为20、40、 60、 80、100 s，液料比为25∶1 mL/g，浸泡时间为60 min，微波功率为240 W。

1.3.3.3 微波功率对地锦草得率的影响

称取1.000 0 g地锦草粉末5份，设定微波功率为80、240、400、640、800 W，液料比为25∶1 mL/g，浸泡时间为60 min，微波时间为40 s。

1.3.3.4 浸泡时间对地锦草多糖得率的影响

称取1.000 0 g地锦草粉末6份，设定浸泡时间为10、20、30、40、50、60 min，液料比为25∶1 mL/g，微波功率为240 W，微波时间为40 s。

1.3.4 响应面试验

在单因素试验的基础上，用D-E软件处理数据，利用Box-Behnken中心组合试验设计原理[5]，选取液料比(A)、微波时间(B)、微波功率(C)、浸泡时间(D)为试验因素，以多糖得率为响应值，进行试验设计，响应面因素水平见表1。

表1 响应面试验设计因素水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 液料比对地锦草多糖得率的影响

见图1。

图1 液料比对地锦草多糖得率的影响

试验表明，液料比的增加有利于地锦草中多糖得率的提高，液料比大于42∶1后，多糖得率反而有所降低。原因可能在于溶剂增多利于多糖扩散溶出，但是液料比继续增加却导致了其他杂质的溶出及部分多糖的分解。因此，液料比选在42∶1左右比较合适。

2.1.2 微波时间对地锦草得率的影响

见图2。

试验结果表明，适当增加微波辐射时间有利于地锦草中多糖得率的提高。当微波时间大于80 s时，多糖得率反而呈现下降趋势。原因可能在于微波有利于细胞膜的破碎而使溶出物增多，但若辐射时间过长时，会使提取体系的部分区域超声温度瞬间上升，多糖分子链在高温时发生分解。因此，微波时间选择80 s左右较为合适。

图2 微波时间对地锦草得率的影响

2.1.3 微波功率对地锦草得率的影响

见图3。

图3 微波功率对地锦草得率的影响

试验结果表明，提高微波功率有利于地锦草中多糖得率的提高，但当微波功率高于640 W时，地锦草多糖的提取率反而呈下降趋势。原因可能是提高微波功率有利于多糖破壁渗出扩散，但功率过大会使得供试液剧烈沸腾，液体从锥形瓶中溢出，同时对多糖的稳定性有一定影响，而使多糖得率降低。因此，微波功率选在640 W左右较为合适。

2.1.4 浸泡时间对地锦草多糖得率的影响

见图4。

图4 浸泡时间对地锦草得率的影响

试验结果表明，浸泡时间延长有利于地锦草中多糖得率的提高，但浸泡时间大于32 min时，多糖的提取率反倒呈现下降趋势。究其原因，可能是初始溶解时，多糖伸出两较大，随着时间的推移，多糖溶解达到饱和，而其他杂质溶解量则慢慢上升。因此，浸泡时间选在32 min左右较为适宜。

2.2 最佳提取工艺的研究

利用Box-Behnken组合设计原理，综合单因素试验考察结果，选取液料比、微波时间、微波功率、浸泡时间为自变量，以地锦草中多糖得率为响应值，称取地锦草粉末1 g，共29份，设计四因素三水平共29个试验点的响应面分析试验。表2为试验方案的设计和数据处理结果，表3为数据方差分析结果。

2.2.1 响应面试验方案的设计和计算结果

见表2。

表2 响应面试验设计和结果

2.2.2 响应曲面分析

对表2结果用D-E8.0软件进行统计分析，得二次回归方程模型为：

Y=-36.94083+0.67667A+1.11525B-0.080067C+0.93617D-0.0238AB+0.0015425AC-0.00905AD+0.000346875BC-0.0006875BD-0.00004CD+0.00933333A2-0.00236042B2-0.00000941667C2-0.00894167D2。回归方程方差分析见表3。

表3 响应面试验方差分析

注：*P值小于0.05为差异显著；**P值小于0.01，表示差异非常显著；***P值小于0.001，表示差异极为显著。

从表3可知，模型回归项F值为3.67，P﹤0.05，说明所选模型显著。各因素的影响大小为液料比﹥微波功率﹥微波时间﹥浸泡时间，表中AB的P值小于0.01，说明它是较显著的模型项。模型失拟项P﹥0.05不显著，相关系数R2=0.783 4，调整系数RAdj2=0.552 6，表明试验结果和数学模型拟合程度高，可用该模型预测试验结果。CV(变异系数)=26.67%，说明模型精确度高，重现性好，试验可信。

2.3 最佳工艺参数验证性试验

对提取率的回归方程模型进行数据处理，得出地锦草中提取多糖的最佳工艺条件为：液料比配制为45 mL/g、微波时间设置为60 s、微波功率设置为483.6 W、浸泡26.2 min，多糖产率的预测值为16.02 mg/g。结合实验室仪器参数，微波功率和微波时间只能设置为整数，最终确定实验条件为：液料比45 mL/g、浸泡时间26 min、微波功率480 W、微波时间60 s。对修正参数下条件平进行3次重复验证试验，得地锦草中多糖的实际提取率为15.81 mg/g，与预测值(16.02 mg/g)相比较试验的结果偏差较小，说明二次多项式数学模型进行等高线叠加所得到的优化区域符合设计目标，试验设计和数学模型具有重现性，通过本试验方法可以得到地锦草中多糖含量较高的提取工艺。

3 结论

笔者以地锦草为原料，用微波辅助法水提醇沉提取地锦草多糖。从单因素水平试验可见：液料比为42∶1，微波时间为80 s，微波功率为640 W，浸泡时间为32 min时多糖得率分别最高。在此基础上设计四因素三水平响应面分析法试验，得出各因素对提取率的影响大小为：液料比﹥微波功率﹥微波时间﹥浸泡时间，最佳提取条件为液料比45 mL/g、微波时间60 s、微波功率483.6 W、浸泡26.2 min，多糖最佳提取率的预测值为16.02 mg/g。验证性试验进一步证明在液料比45 mL/g、浸泡时间26 min、微波功率480 W、微波时间60 s时，地锦草中多糖提取率达到15.81 mg/g。本试验结果可为规模化提取地锦草多糖提供一定的参考，更优化的提取工艺及多糖的理化的性质均有待进一步的深入研究。