文/秦勇 李勤慎 邵东宏

本实验采用多种精子稀释液分别在冷冻前和冷冻后进行激活，结果表明祁连山裸鲤精子在D-15与Kurokura-1中活力较好，达到了（72±5）%，较为接近鲜精的活力。利用10%抗冻剂（DM）来进行裸鲤精液的超低温保存研究，发现D-15保存后的精子活力较高，达到了（35±5）%。

祁连山裸鲤是祁连山脉的土著鱼类，主要存在祁连山脉的冰川融水中，是一种重要的冷水性鱼类地方品种，对当地的水域生态系统有重要作用。但由于生态环境的不断恶化，野生裸鲤的种群数量不断下降，自然环境中的分布数量减少，保护裸鲤种质资源显得尤为重要。

目前，主要通过祁连山裸鲤的人工繁育、增殖放流来提高其自然种群数量。诸多原因限制了人工繁育的开展，较为重要的一点是雄鱼和雌鱼成熟时间不一致，雄鱼先熟雌鱼后成熟。其对药物又较敏感，无法使用药物来达到同期成熟，导致成熟的精液无法使用，而卵子成熟后又没足量的精液来进行受精使整体的繁育数量减少，因此对高质量的精液进行保存是一项重要的任务。

一、材料与方法

（一）实验设计

将采集好的精液用筛选出的稀释液进行稀释，抗冻剂为二甲亚砜（DMSO），将精子用预冷的稀释液—精子用预混合物按10:1稀释，DMSO的终浓度为10%左右。将稀释好的精液分两组装入冻存带盖塑料管中并在4℃平衡数分钟，然后进行冷冻保存。解冻采用温水浴（37℃左右）快速摇动解冻法，解冻后，用一定浓度NaCl溶液激活冻精，在显微镜下观察精子活力及寿命。

（二）实验材料

1.实验仪器

BM1000型生物显微镜、液氮罐、冻存管、胶头滴管、注射器、50mL试管、1mL移液枪、200μL移液枪、移液枪枪头、载玻片、细胞计数板、手套。

2.实验药品

10%甲醛溶液、10%DMSO溶液、Kurokura-1溶液、D-15、Els溶液、鱼用任氏液、Bs-2溶液、Ss溶液、祁连山裸鲤的新鲜精液、水。

（三）实验方法

1.稀释液的配置

利用NaCl、KCl、NaHCO3、葡萄糖、CaCl2、MgCl2·6H2O和抗冻剂（DM）配置精液精液保存稀释液，详见表1。用不同的稀释液稀释精液，并进行精子活力（精子活力是指运动精子占全部精子的百分比）观察，对配置稀释液进行筛选，选取两种精子活力最好的稀释液分别进行祁连山裸鲤的低温保存以及超低温保存。

2.精液的采集

祁连山裸鲤的新鲜精液来源于甘肃省祁连雪冷水鱼良种养殖场，精液的采集方法为腹部挤压法，选择成熟的雄鱼，用湿润的毛巾将鱼体裹住，鱼体腹部朝上，用纸巾将生殖孔周围的水滴擦干，以免混入精液，导致精液失活。自前向后轻轻挤压鱼体腹部至生殖孔流出乳白色精液，利用1mL注射器吸取精液，防止尿液和水混入，将收集的精液带回实验室进行实验。

3.稀释液的筛选

用6种精子稀释液稀释20倍后，用牙签醮取少许精液涂在载玻片上，置于显微镜下，滴加1滴2℃的淡水激活，利用400倍显微镜观察精子活力，连续取样观察3次，统计每次观察到的精子活力。筛选出两种活力较好的稀释液备用。

表1 稀释液配方表

图1 精子稀释液活力对比（3个系列代表三组平行试验）

图2 低温保存对比

4.保存

用筛选出的稀释剂稀释后在0～4℃下进行低温保存，观察记录数据，然后用二甲基亚砜（DMSO）和甲醇（MeOH）以3:2的比例配制成混合抗冻剂（DM），利用筛选出的适宜的精子稀释液以10:1的比例稀释精液，再分别加入10%的混合抗冻剂DM。

将稀释后的精液注入2mL的冷冻管中，每管中加入1mL精液，0～2℃平衡5min～10min。将冷冻管装入小布袋中，先在距液氮面以上10cm处平衡10min，再在液氮面以上5cm处平衡5min，然后直接将小布袋吊入液氮罐-196℃中冷冻保存。

精液冷冻2 h～3 h后，将小布袋从液氮中提出至液氮蒸气中平衡1min～2min，再将冷冻管从布袋中取出，放入事先准备好的37℃水浴中摇动解冻约2min，待精液可以流动即可。

用牙签醮取少许解冻后的精液涂在载玻片上，置于显微镜下，滴加1滴2℃的淡水激活，利用400倍显微镜下观察精子活力，连续取样观察3次，统计每次观察到的精子活力，记录数据。

二、数据处理与讨论

（一）稀释液稀释后数据处理

利用配置的六种稀释液进行低温保存实验后，结果（见图1）表明D-15与Kurokura-1在祁连山裸鲤精液低温保存的过程中效果较好，精液保存后精子活力可达到（72±5）%，而其他的稀释液精子活力与鲜精对比差异较为明显，鱼用任试液与Bs-2中钙离子含量较高，不适用于鱼类精液保存，精子成活率较低，Els中葡萄糖浓度较高，稀释液浓度高于精液的的渗透压，精子成活率较低。因此选取D-15与Kurokura-1来进行精子的保存研究。

（二）低温保存后数据处理

低温保存与保存时间成反比，随着时间的增加成活率不断降低，结果（见图2）表明D-15与Kurokura-1在稀释后第一天精子的成活率都较高，但是Kurokura-1随后几天成活率下降较快，D-15成活率下降较平稳，两种稀释液在第三天后都有一个较为明显的下降幅度，精子的成活率较低，所以在低温保存中时间是对精子成活率有直接影响，实验低温保存时三天内精子成活率较高，保存效果较好。

（三）冷冻保存后的数据处理

经过冷冻保存后发现D-15（见图3）与Kurokura-1（见图4）对精液保存后活力有较大影响，抗冻剂（DM）对精子有毒性，降低了精子的成活率。不同鱼类精子对抗冻剂种类和浓度的适应性不同，通常鱼类精子冷冻中加入8%～15%DMSO（陈松林等，2007）。但利用单一抗冻剂无法获得成活精子，所以用DMSO与甲醇（3:2）获得的10%混合抗冻剂（DM）（田永胜等，2014）进行的预实验发现裸鲤精子成活率较好。

三、结果与讨论

本实验筛选得到的更为适宜祁连山裸鲤精子的保存稀释液为D-15，在同等时间内低温保存效果优于Kurokura-1，精子成活率曲线下降幅度较为平缓，并且在超低温冷冻前的精子活力可以达到（72±5）%，冷冻后精子活力在（35±5）%，精子活力也高于Kurokura-1。在裸鲤的人工繁育中可以采用这两种方法来进行精液保存，保存时间短即可用低温保存。

图3 D-15冷冻前后对比

图4 kurokura-1冷冻前后对比

裸鲤的精液保存研究是对祁连山裸鲤种质资源的保存与恢复的一项有效途径。当鱼类精子离体后由于环境不适、营养消耗和代谢产物积累等原因，会导致精子寿命减短，并很快死亡。适宜的稀释液能为精子提供一个相对适合的生理环境，延长其在体外的存活时间，并防止精子被激活。因此，在鱼类精子冷冻保存中稀释液的作用至关重要，稀释液的配制应尽量与鱼体的生理环境接近这样可以在最大程度上保证精子在体外的存活时间。

利用稀释液和抗冻剂等对成熟的精液进行保存，然后在卵子成熟后使用，大大的提高了精液的使用效率，增加了受精卵的数量，可进行较大规模的增殖放流，可以对野生祁连山裸鲤的种群数量有较大幅度的恢复，增加野生祁连山裸鲤的数量。