王朝雅，杨 培，王 波，彭艳琼

(1.中国科学院 西双版纳热带植物园热带森林生态学重点实验室，云南 昆明 650223；2.中国科学院大学，北京 100049)

1 引言

传粉生物学是植物生殖生态学和进化生物学关注的焦点之一，主要研究植物花部特征对特定传粉媒介的适应[1]。了解植物的花部特征、开花样式随时间的变化以及相应的访花昆虫访问频率，是理解植物传粉机制的基础，对于特定植物的保护具有重要的参考价值。由于植物固着生长的习性，其花粉传递往往依赖特定的媒介，约87.5% 的被子植物依赖动物传粉[2]。在形形色色的传粉动物中，传粉昆虫发挥着重要的作用，可为90% 的野生植物和75% 的粮食作物传粉[3]。因此，传粉昆虫对植物的繁衍是不可或缺的。它们不仅是自然生态系统的重要组成部分，维持着生态系统的动态平衡[4]，同时对于人工生态系统(如：作物生态系统和果园生态系统)的经济效益具有直接影响[5]。

植物的花部特征包括花部构成和花的开放式样[6]。处于不同开放时期的花在结构、颜色、气味和提供给访花昆虫的报酬上存在着变化，从而影响访花者的行为[7,8]，其变化的速度与昆虫的授粉过程紧密相关。而传粉昆虫对植物的识别很大程度上依靠花挥发物这一古老的信号[9]。花气味中挥发性化学物质的组成和含量随着花的发育不断变化[10～12]，一方面显示了植物发育阶段的变化，另一方面调节着传粉昆虫访花、采蜜等多种行为[13～15]。尤其是在开花前后，花的挥发物在质、量上的变化尤为显著，这种变化会对特定的传粉者产生显著的影响[16]。因此，结合植物花的发育动态以及挥发物的变化，能更好地了解植物传粉昆虫的多样性及其互作机制。

在森林生态系统中，传粉生物学主要聚焦研究那些花结构特殊、小种群或濒危的植物，以及专性的传粉系统[17-19]，针对群落中重要和优势的植物，研究它们的传粉生物学规律。热带雨林拥有最为丰富的物种，是生物多样性保护的优先区域。在西双版纳热带雨林中，假海桐(Pittosporopsiskerrii)种群数量巨大，是林下层乔木优势树种，在20 hm2的热带雨林动态监测样地中，假海桐重要值排名第二，影响着群落组分和周围生境的变化，是决定群落演替的主要因素[20,21]。然而，目前没有关于假海桐传粉生物学的报道，也未见其花气味方面的研究。因此，本研究以热带雨林优势种假海桐为研究对象，跟踪其开花物候、观察其开花特征，并在花期调查其访花昆虫种类及访花频次，收集昆虫传粉前、后的花气味，分析其差异，揭示假海桐传粉生物学特点，为热带雨林保护提供依据。

2 材料和方法

2.1 研究地点及材料

研究地点位于云南省西双版纳傣族自治州勐腊县境内的中国科学院西双版纳热带植物园(21°41′N，101°25′E)和补蚌大样地内(21°60′N，101°59′E)。西双版纳年平均气温21.4 ℃，月平均气温最低16.0 ℃(1月)，最高25.7 ℃(7月)，年平均降水量1500 mm，属典型的热带季风气候，根据降水变化，一年可分为雨季、雾凉季和干热季[22]。

假海桐(PittosporopsiskerriiCraib)隶属于茶茱萸科(Icacinaceae)、假海桐属(Pittosporopsis)，灌木或小乔木，高1～17 m，树皮红褐色，小枝近圆柱形，具稀疏的皮孔。叶长椭圆状倒披针形至长椭圆形，长12～22 cm，宽4～8.5 cm，表面深绿，背面浅绿，具光泽。花序长3～4.5 cm，被微柔毛；花芽绿色，长圆形；花瓣匙形，长5～7 mm，宽1.5～2 mm，黄绿转白绿，最后为白色，具香味；雄蕊与花瓣几等长，花丝扁，花药丁字着生，白色；子房圆锥形，花柱棒状。核果近圆形至长圆形，长2.5～3.5 cm，径约2～2.5 cm，白绿色。假海桐喜生于海拔350～1 600 m的山溪密林中，是热带雨林下层的优势树种。国内产云南西双版纳、沧源、红河等地，在缅甸、泰国、老挝至越南北部也有分布。

2.2 开花动态观察

在花期，选择3株假海桐(P.kerrii)，在每株树上选取尚未开放的花序，3株共选取20枝花序，从花蕾期开始进行观察。每天18:00～19:00观察1次，直到花朵完全开放时为止，每次观察时记录当日新开放小花数目。按照Dafni的方法记录雌雄蕊空间位置及成熟时间[23]，用TTC染色(2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazolium chloride)法测定花粉的活力和寿命，同时采用过氧化氢法和MTS染色法测定柱头可授性。测定花粉活力的方法：盛花期采集开花天数不同的花药，置于凹玻片中，用软毛刷轻刷花粉粒，并用解剖针将已开裂的花粉囊中的花粉粒轻轻挑出，之后滴加含0.5% TTC的蔗糖溶液30 μL，迅速盖上盖玻片，放入内置湿滤纸的培养皿中，在37 ℃的黑暗条件中培养3 h后镜检。每样品做10块玻片的重复，每个玻片选取3～5个不重叠视野进行观察，计数染色和未染色花粉粒数，计算花粉的染色率，以染色率表示花粉的活力及寿命。测定柱头可授性的方法：盛花期采集开花后不同天数的小花花柱30个，用镊子取下花柱，注意不要划伤柱头，将每个花柱的柱头置于凹玻片中，滴加10μL过氧化氢和MTS溶液，完全浸润柱头，然后迅速移至体视镜下观察，并记录产生气泡的情况。若柱头周围产生大量气泡，则显示柱头有较强活力，具较强可授性；若柱头周围产生少量气泡，则说明柱头活力较差，可授性弱；若柱头周围未产生气泡，则显示柱头没有活力，不具可授性。滴加MTS溶液的凹玻片闭光处理30 min后转移至体视镜下观察，再记录染色情况。若柱头呈深蓝紫色，则显示柱头有活力，具有可授性；若柱头浅染色说明柱头活力差，可授性弱；若柱头颜色不变，则显示柱头没活力。此外，选取41枝花序(共1204朵小花)，在花蕾期进行套袋隔离处理，避免昆虫异花授粉，以检查假海桐的自交结实情况。

2.3 访花昆虫观察

假海桐开花有始花期、盛花期和末花期之分，在开放花朵较多的盛花期直接观察、拍照记录昆虫的访花频次，观察有无接触到雄蕊和柱头的传粉行为，当访花昆虫接触到雄蕊和柱头时，记为一次访花传粉。野外难于直接鉴定的昆虫种类，采回室内，制作标本进行种类鉴定。在3株树上开展系统观察，每株树在东西南北4个方向，每个方向观察5 min，共观察20 min，在10:00～18:00期间对3株树间轮流观察，每株树观察8次，连续观察3 d。

2.4 假海桐花化学挥发物的收集和鉴定

2.4.1 动态顶空吸附法收集假海桐花化学挥发物

在假海桐出现花蕾时，用120目白色纱网袋套袋隔离传粉昆虫。每株树进入盛花期时(此时昆虫访问频率明显增加，而花药完整，花瓣新鲜，未显衰败)，于上午11:00～12:00 移走纱网袋，迅速采集同一株上的30朵花，及时收集传粉前的花气味。传粉后的花(花药不完整，花瓣不新鲜)在下午16:00～17:00进行，在同一株树上再采集30朵花，收集传粉后的花气味。

采用动态顶空吸附法收集花气味[24]。主要工作流程：将采集好的传粉前、后的各30朵花分别装入无味透明的聚氟乙烯采集袋(2 L, Teflon FEP, 大连德霖气体包装有限公司)中，袋两端分别留有进气口和出气口。首先，用气体采样仪的出气口，将空气通过活性碳管(外径6 mm，长75 mm, SigmaAldrich, 美国) 进行净化，之后气体经由进气口进入袋中，由另一气泵通过出气口将挥发的气味抽出，导入Porapak Q [100 mg (50 mg)-1, 60/80目, Sigma-Aldrich, 美国]吸附管(外径6 mm，长75 mm)中进行吸附。通气端和出气端空气流量控制流速均为250 mL/min。连接装置器件之间均用无味的特氟隆管(PTEE, VICI Jour, 瑞士)连接，同时用未放置花的空采样袋作为对照。采集时间3.5 h，采集完毕的样品用锡箔纸包裹吸附管并装入密封袋内，置于冰盒带回实验室。用色谱纯正己烷洗脱3次，收集约0.5 mL洗脱液于2 mL棕色进样瓶中。随后用氮吹仪浓缩至250 μL，置于-20 ℃冰箱中保存待分析。最终，传粉前花气味收集到10个样品，传粉后的花气味收集到9个样品。

2.4.2 花挥发物的鉴定

收集到的19个样品均采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS; GC, HP-7890A; MS, HP-5975C; Agilent Technologies, USA)进行分析。

(1)GC分析条件：HP-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm × 0.25 μm)；进样采用分流模式，分流比5∶1，分流流量5 mL/min。进样量为1 μL，柱起始温度40 ℃保持0 min，以每分钟3 ℃升温至150 ℃；再以每分钟10 ℃升至260 ℃，保持5 min。进样口温度 250 ℃；载气为高纯 He，流速9 mL/min。

(2)MS分析条件：离子轰击源设为扫描功能，扫描范围50～550 amu，离子源温度 230 ℃；四级杆温度150 ℃。

(3)挥发物的鉴定：假海桐花挥发性化合物的分析鉴定首先利用仪器自带的标准谱库(NIST08)检索目标化合物，然后根据保留时间计算保留指数，参考NIST Chemistry WebBook(https://webbook.nist.gov/chemistry/)上各化合物的保留指数，以确定挥发物的化学成分。运用峰面积归一化法计算气味各组分的相对百分含量。

2.5 数据分析

使用Microsoft Excel 2010和R3.5.1软件对数据进行分析。对于假海桐花气味的数据分析：用t检验分别比较各个化合物传粉前后相对含量的差异。然后采用Vegan包，基于Bray-Curtis距离构建的距离矩阵，采用非度量多维度尺度分析(NMDS, nonmetric multi-dimensional scaling)方法[25]比较假海桐传粉前后的挥发性化合物构成相似性。该方法基于Bray-Curtis距离构建两两样本间的距离矩阵，对多种化合物的高维数据进行降维处理，根据Bray-Curtis距离计算NMDS距离，得到stress值(这个值表示NMDS距离与Bray-Curtis距离的拟合程度，越小表明拟合越好)，最后在二维平面上显示假海桐花传粉前后化合物组成的NMDS距离。然后用相似性分析(ANOSIM, analysis of similarity)进行传粉前后化合物构成差异显著性检验。ANOSIM针对多元数据(多个因变量)，采用了重抽样的方法，比较类别间(传粉前、后)的整体统计差异。

3 结果和分析

3.1 假海桐开花特性

假海桐于12月初开始出现花芽，翌年2月下旬第一朵花苞开放，进入始花期。花序的开花次序为自上而下开放，每天开放1～27朵不等，通常为4～8朵。受温度和湿度的影响，晴天开花数较多，雨天和阴天开花数较少。一般一个花序自第一朵开放到最后一朵开完需5～10 d，单花期为3～4 d。单株始花期后5～7 d进入盛花期，花期持续时间8～10 d。假海桐树间花期不同步，主要集中在2～3月份，种群内花期可持续6～7个月。假海桐开放的花朵中，花瓣5瓣，雌蕊1枚，雄蕊5枚，花药与柱头等长；假海桐雌雄蕊异步成熟，花粉活力在开花初期表现最高，之后缓慢下降，花粉寿命共48 h；开花初期柱头不具可授性，在开放24～48 h时柱头可授性最高，开放72 h时柱头有较弱的可授性，整个柱头可授期约为72 h(表1)。在套袋隔离防止异花授粉的试验中，1204朵假海桐花，最终仅有1果发育成熟，自交率仅0.07%，说明假海桐依赖昆虫传粉，偶尔自交可结实。

表1 假海桐花粉活力和柱头可授性

-: 柱头不产生气泡或未被染色，不具可授性； +: 柱头产生少量气泡或被浅染色，具较弱可授性；++: 柱头产生大量气泡或被染为深蓝紫色，具强可授性

3.2 访花昆虫种类

在假海桐盛花期，对访花昆虫进行系统观察和记录，共观察到访花昆虫54种，记录到昆虫访花847次，其中膜翅目昆虫占70.5%，主要是蜜蜂、蚂蚁、胡蜂和泥蜂；鳞翅目蝴蝶类占18.0%，包括云南丽蛱蝶(Parthenossyvia)、幻紫斑蛱蝶(Hypolimnasbolina)、龙女锯眼蝶(Elymniasnesaea)等；双翅目昆虫占10.6%，有食蚜蝇、丽蝇、寄蝇等；鞘翅目昆虫占0.8%，涉及叶甲、象甲、隐翅甲等，以及仅占0.1%的半翅目昆虫刺缘蝽(Cletus trigonus)(图1和图2)。总体上，隶属于膜翅目的大蜜蜂(Apisdorsata)访花频次最高，达450次，占53.1%，其次是东方蜜蜂(A.cerana)访花103次，占12.2%，云南丽蛱蝶访花56次，占6.6%，其余昆虫访花总计238次，占28.1%。其中大蜜蜂和东方蜜蜂每次访花均伴有接触雌雄蕊的传粉行为，并且其头部、足、背部都携带了花粉，可以确定大蜜蜂是假海桐最为优势的传粉昆虫。

A：大蜜蜂；B：食蚜蝇；C：云南丽蛱蝶；D：三锥象

图2 假海桐访花昆虫种类及比例

3.3 传粉前后假海桐花释放的挥发物类别及含量变化

从假海桐传粉前后的花气味中共鉴定出13种化合物(表2)，这些化合物可以归为3大类：包括9种萜烯烃类化合物、3种芳香族化合物及1种脂肪酸衍生物。3类化合物在传粉前的相对含量分别为萜类98.21%、芳香族化合物0.84%和脂肪酸衍生物0.95%，而传粉后3类化合物含量变化分别为88.52%、10.16%和1.32% (图3)。

3.4 传粉前后假海桐花各挥发物相对含量的变化

传粉前花气味共收集到12种化合物，主要成分(相对含量>5%)包含5种：α-甲基-α-[4-甲基-3-戊烯基]环氧乙烷基甲醇(44.17%)、顺-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇(21.73%)、芳樟醇(8.51%)、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢-2H-呋喃-3-醇(9.51%)和罗勒烯(6.46%)。传粉后花气味有13种化合物，新增化合物对仲丁基-2,6-二叔丁基苯酚(4.35%)，其它主要成分与传粉前的一样，但相对含量发生变化：α-甲基-α-[4-甲基-3-戊烯基]环氧乙烷基甲醇(35.77%)、顺-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇(22.07%)、芳樟醇(12.26%)及罗勒烯(5.67%)(表2)。可以看出，α-甲基-α-[4-甲基-3-戊烯基]环氧乙烷基甲醇在假海桐传粉前后的挥发物中含量均最高，并且传粉前显著高于传粉后(P<0.05)。随着昆虫的传粉进程，2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢-2H-呋喃-3-醇相对含量显著减少(P<0.05)，而樟脑、对乙基苯乙酮和3-乙基苯乙酮的相对含量显著增加(P<0.05)，其余化合物传粉前后相对含量变化不大(图4)。

表2 传粉前后假海桐花化学挥发物的构成

图3 传粉前后假海桐花气味化合物类别相对含量

*：显著；n.s.：不显著；A：α-甲基-α-[4-甲基-3-戊烯基]环氧乙烷基甲醇；B：顺-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇；C：芳樟醇；D：四氢-2,2,6-三甲基-6-乙烯基-3-吡喃酮；E：(3R，6R)-2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢-2H-吡喃-3-醇；F：2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢-2H-呋喃-3-醇；G：罗勒烯；H：苯甲酸甲酯；I：对乙基苯乙酮；J：3-乙基苯乙酮；K：樟脑；L：(E)-2,6-二甲基-3,7-辛二烯-2,6-二醇；M：对仲丁基-2,6-二叔丁基苯酚

图4假海桐花挥发物中的13种主要化合物在传粉前后的变化

3.5 假海桐传粉前后花气味的相似性

通过对假海桐花传粉前10个样品和传粉后9个样品的挥发物进行NMDS分析(Stress=0.13，R2=0.98)，并用多边形将它们在二维平面上的分布表示出来(图5)。结果显示：假海桐花被传粉前后挥发物构成在NMDS距离上虽然有部分重叠，但明显分离，且ANOSIM检验结果表明传粉前后假海桐花化学挥发物构成组间差异显著(R=0.16，P<0.05)。

图5 假海桐花传粉前后相似性的多维尺度分析

4 讨论

分布于热带雨林林下的假海桐花小、簇生，白色，花药与柱头等长，具有花蜜，味清新。其花期早，种群花期持续时间长，单花期3～4 d，开花第一天花粉活力最高，但柱头不具可授性，这有利于促进异交授粉。我们的研究结果显示开花的第2～3 d花粉活力与柱头可授性同步，以及花药与柱头等长特点，可能存在自交亲和，进一步通过花期隔离授粉试验显示假海桐自交率仅0.07%，说明假海桐依赖昆虫传粉，偶尔自交可结实。假海桐也显示了虫媒花的特点：白天开放，以明亮的颜色及清新而不浓郁的花香吸引传粉者，其两侧对称的花形，可以为昆虫提供着陆平台，便于昆虫落下并深入花中采蜜授粉。本研究中共观察到假海桐花期访花昆虫54种，物种组成多样性较高，多种传粉昆虫有助于保障林下假海桐的繁殖成功。

在自然界的传粉昆虫中，膜翅目蜜蜂总科(Apoidea)的蜂类是最为理想的传粉昆虫[26]。在对假海桐访花昆虫的观察中，记录到的膜翅目昆虫包括蜜蜂、蚂蚁、胡蜂和泥蜂，其中大蜜蜂的访花频次占总频次的53.1%，并且每次访花都伴随着采粉行为，可以确定假海桐最为优势的传粉昆虫是大蜜蜂。有研究表明，膜翅目蜜蜂科昆虫偏爱黄色、蓝色、白色的花[27]，假海桐花色从黄绿转白绿，最后为白色，因此簇生的白色花也可能有利于吸引大蜜蜂传粉。大蜜蜂飞行能力强，可克服热带雨林植株各冠层间距较大的困难，是实现花粉散布和基因流动的主要动力[28]。同时大蜜蜂具有很好的传粉服务功能，是热带雨林大多数植物和多种热带农作物的有效传粉昆虫[29～31]。假海桐能在郁闭度极高的热带雨林林下层拥有最高的种群数量，可能与为之传粉的大蜜蜂息息相关。

假海桐花传粉前后挥发物共鉴定出化合物13种，由萜烯类化合物、脂肪酸衍生物及芳香族化合物三类构成。传粉前后含量最高的化合物都是α-甲基-α-[4-甲基-3-戊烯基]环氧乙烷基甲醇，该种化合物常见于植物花瓣和叶子的挥发性油中[32～34]，是假海桐花气味的基本组成物质。植物挥发物通常以“泛化”和“特化”两种方式实现其对传粉者的特异性吸引[35]。假海桐花气味中含量最多的物质虽不常见于茶茱萸科其他花挥发物中，但所含芳樟醇、罗勒烯、樟脑等是植物花挥发物中常见的物质[36]，可见其执行的是“泛化”的化学通讯策略。有报道苯酚类物质对传粉昆虫具有强烈的引诱作用[13]，传粉后新出现对仲丁基-2,6-二叔丁基苯酚可能有活性，是吸引还是趋避值得深入研究。聚类分析时传粉前后化学挥发物部分重叠的原因推测可能是假海桐伞状、簇生的花序，小花授粉程度差异导致的。最终，白色簇生的花朵及花释放的多种挥发物，共同从视觉和嗅觉方面吸引昆虫为假海桐传粉。更为重要的是在高度郁闭的林下层，假海桐冬春较早开花，错开花期有利于吸引传粉昆虫，保障假海桐的繁殖。

近几十年来，版纳地区发展以橡胶树为主的经济作物种植，使得大量的原始森林遭到砍伐。随着原始森林的破碎化和人为干扰的加剧，导致该地区生物多样性急剧下降[37,38]。有限的热带雨林是生物多样性保护的优先区域，本研究第一次针对复杂的热带雨林生态系统，从林下层最为优势和重要的假海桐着手，开展传粉生物学研究，初步的研究数据从传粉繁殖角度揭示了假海桐大种群，成功占据林下层生态位的适应性策略，进一步研究将为热带雨林保护、恢复提供参考。