孙 艳， 石 光， 胡春梅， 张 雪， 顾佳颖， 迟宝荣

1.吉林大学第二医院肿瘤·血液内科，吉林 长春 130041； 2.郑州大学第一附属医院消化内科

原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis，PSC)是一种慢性胆汁淤积性疾病，目前缺乏有效的治疗药物，大多数患者发展为终末期肝病，其发病机制至今不清[1]。2006年，TAKAHASHI等[2]通过将Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4 4种基因，以逆转录病毒为载体导入小鼠成纤维细胞，诱导体细胞回归到类似于胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)的未分化、具有高度发育潜能的状态，创造了诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)新技术。iPSCs的发现为肝脏疾病的研究提供了新的契机[3-4]。

应用iPSCs技术构建患者特异性的疾病模型可用于研究疾病的发病机制，筛选候选药物库。使用特定患者的iPSCs细胞可重演单基因和迟发性多基因遗传性疾病表型，如帕金森氏病[5]、阿尔茨海默氏病[6]。用这些细胞来分析发病机制和研究潜在的新治疗方法，已经成为研究的热点及趋势。因此，本研究旨在重编程PSC患者皮肤成纤维细胞，获得疾病特异性的iPSCs细胞，以期后续进一步向胆管细胞诱导分化用于研究疾病的发病机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器Nutristem XF/FF 培养基购自Stemgent公司，mTeSR1培养基、STEMdiff 三胚层分化试剂盒购自Stem Cell Technologies公司，Matrigel购自R&D systems公司，TrypLETMSelect胰蛋白酶替代酶购自GIBCO公司，CytoTuneTM-iPS 2.0仙台重编程试剂盒购自Life Technologies公司，OCT4 抗体购自Cell Signaling Technology公司，SSEA、TRA-1-81、FoxA2抗体购自Merck Millipore 公司，NANOG、Nestin、SOX17、Pax-6抗体购自Abcam 公司，Brachyury、NCAM抗体购自Invitrogen公司，激光共聚焦显微镜Zeiss LSM 510是德国Carl Zeiss公司产品。

1.2 PSC患者皮肤成纤维细胞培养PSC患者和健康对照者皮肤成纤维细胞来自梅奥诊所 Robert Huebert实验室肝脏患者源性生物库。皮肤成纤维细胞用质量浓度为100 g/L FBS的DMEM培养基，置于37℃、体积分数为5%的CO2、湿度95%的CO2孵箱中培养，每3 d更换培养液1次，7 d左右细胞传代1次。

1.3 仙台病毒系统重编程人皮肤成纤维细胞将稳定生长的第3代成纤维细胞接种于12孔培养板，参照 CytoTuneTM-iPS 2.0仙台重编程试剂盒说明书，转染该细胞，待3～4周获得ESCs样阳性克隆后，显微镜下用P200移液管挑取克隆，按每孔1个克隆接种于GeltrexTM基质预先包被的96孔培养板中，更换mTeSR1培养基继续扩增培养及筛选。

1.4 iPSCs生物学特性鉴定

1.4.1 细胞形态学观察：应用Nutristem XF/FF 培养基添加质量浓度为160 g/L mTeSR1培养基、mTeSR1 5×补充剂、50×StemGS和质量浓度为10 g/L青霉素/链霉素扩增培养iPSC细胞，每天换液，根据细胞密度应用TrypLETMSelect胰蛋白酶替代酶每3～7 d以1∶2～1∶8的比例传代1次，质量浓度为1 g/L Matrigel预先包被培养板，倒置相差显微镜下观察iPSCs细胞形态。

1.4.2 流式细胞术检测ESCs抗原的表达：流式细胞检测第10、15、20代PSC疾病源性iPSCs ESCs标志性抗原Oct4、TRA-1-81、SSEA和Nanog的表达，将收集的各代iPSCs细胞用质量浓度为40 g/L的多聚甲醛固定20 min，FACS缓冲液(质量浓度为20 g/L FBS+DPBS)洗3次，质量浓度为5 g/L BSA的FACS缓冲液室温下阻断30 min，细胞悬液300×g离心5 min，吸去上清液。加入Oct4、TRA-1-81、SSEA和Nanog一抗冰上放置30 min，洗3次后加入荧光标记的二抗，避光放置冰上60 min后再洗3次，上机检测，每代重复检测3次。

1.4.3 体外分化能力检测：将培养10代的PSC疾病源性iPSCs分别向内、中、外胚层分化，1～2周后行免疫荧光染色，鉴定各胚层标志性抗原的表达。具体为应用STEMdiff三胚层分化试剂盒外胚层诱导培养基诱导iPSCs细胞向外胚层分化6～10 d，中胚层诱导培养基诱导iPSCs细胞向中胚层分化5 d，内胚层培养基诱导分化5 d，收集各诱导分化后的细胞多聚甲醛固定30 min，经Triton X-100渗透，FBS封闭细胞，分别加巢蛋白(Nestin)、Pax-6、NCAM、Brachyury、FoxA2、SOX17一抗孵育细胞4 ℃过夜，之后荧光标记的二抗孵育细胞1 h，PBS洗涤后DAPI复染，激光共聚焦显微镜下观察。

1.4.4 染色体核型分析：取扩增培养15代处于对数生长期的PSC疾病源性iPSCs细胞，加入秋水仙素继续培养2～6 h，收集细胞，加入新配制的甲醇：冰乙酸(1∶3)固定液固定，常规制片，Giemsa染色5～10 min显带，镜检进行细胞核型分析。

1.5 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 iPSCs细胞形态学观察倒置相差显微镜下观察典型的iPSCs细胞克隆呈圆形或椭圆形，边界清晰，克隆内细胞排列紧密，细胞体积小、核大、细胞核/质比高(镜下直接观察无染色)。正常对照和PSC疾病源性iPSCs在形态上无明显差异(见图1)。

图1 正常对照和PSC疾病源性iPSCs克隆的形态(10×) Fig 1 The morphology of normal controls and PSC disease-derived iPSCs clones (10×)

2.2 iPSCs ESCs抗原的表达流式细胞分析PSC疾病源性第10、15、20代iPSCs ESCs标志性抗原Oct4、TRA-1-81、SSEA和Nanog的表达，结果显示ESCs标志性抗原双表达阳性细胞均占90%以上。PSC疾病源性第10、15、20代iPSCs Oct4+Nanog+细胞为(96.72±1.38)%、(95.83±2.56)%、(94.87±1.73)%，各代细胞ESCs标志性抗原表达差异无统计学意义(P>0.05)。图2显示第15代PSC疾病源性iPSCs Oct4+Nanog+细胞96.4%，TRA+SSEA+细胞97.52%，Oct4+TRA+细胞94.37%。

2.3 体外分化能力检测PSC疾病源性iPSCs细胞克隆向外胚层诱导分化6～10 d后，免疫荧光染色检测结果显示，细胞高表达外胚层标志物Nestin(红色荧光)和Pax-6(绿色荧光)(见图3A)；向中胚层诱导分化5 d的细胞表达中胚层标志物NCAM(红色荧光)和Brachyury(绿色荧光)(见图3B)。iPSCs细胞向内胚层诱导分化5 d后，检测到内胚层标志物FoxA2(红色荧光)和SOX17(绿色荧光)的表达(见图3C)；向三个胚层诱导分化后各胚层标志抗原的表达显示获得的PSC疾病源性iPSCs具有发育全能性。

图2 PSC疾病源性iPSCs ESCs抗原的表达 Fig 2 The expression of antigen of ESCs in PSC disease-derived iPSCs

图3 PSC疾病源性iPSCs细胞体外分化各胚层标志物的表达(20×) Fig 3 Expression of various germ layer markers in vitro differentiation of PSC disease-derived iPSCs(20×)

2.4 染色体核型分析扩增培养15代的PSC疾病源性iPSCs细胞进行细胞核型G带分析显示，染色体核型正常，表明在体外培养传代过程中PSC疾病源性iPSCs细胞保持稳定正常的染色体核型(见图4)。

图4 细胞核型检测-46，XY(G带)，核型正常 Fig 4 Cell karyotype detection-46, XY (G band), the karyotype was normal

3 讨论

iPSCs技术是将Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4等重编程因子导入体细胞强制性表达，从而诱导细胞回归为形态、基因表达、细胞自我更新以及分化潜能等方面与胚胎干细胞相似的细胞[7]，以上4种因子也被称为Yamanaka因子。重编程因子的导入方式最初通过包装逆转录病毒和慢病毒进行，但该类病毒载体和外源性重编程因子在受体细胞基因组中的永久整合存在致瘤等安全隐患[8]。

其后也有较多研究利用腺病毒、仙台病毒等非整合型病毒来导入外源基因。仙台病毒是单负链的RNA病毒，通过与细胞表面的唾液酸受体上附着，可感染多种类型的细胞。作为病毒载体的优势主要在于表达外源基因高效且可调控，生活周期完全在胞质中进行，无整合风险，安全性高，被定义为高效的基因转导工具[9]，因此本实验也采用了仙台病毒作为载体。在提高重编程安全性及效率问题的研究中, 应用无病毒的转导方式也在不断探索中，如转座子[10]、蛋白质介导[11]、小分子化合物添加[12]等方法，但上述方法普遍重编程效率不高。因此，iPSCs的临床安全应用仍需要研究高效、无外源性遗传物质整合的载体。

对重编程后的iPSCs所获得的发育全能性一般通过检测ESCs标志物的表达，体外各胚层诱导分化能力，体内畸胎瘤形成等方法进行鉴定[13]，本实验采用Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4重编程因子和仙台病毒载体诱导获得的PSC疾病源性iPSCs在形态上呈典型ESCs样克隆，流式细胞分析显示高表达Oct4、TRA-1-81、SSEA和Nanog等ESCs标志性抗原，且多次传代之后ESCs标志性抗原表达无降低，体外向内、中、外三个胚层诱导分化后免疫荧光染色均检测到各胚层标志抗原的表达，在传代过程中保持稳定正常的染色体核型，提示该方法成功重编程PSC患者源皮肤成纤维细胞，获得具有发育全能性的iPSCs。

近年来PSC研究中揭示了胆管上皮细胞作为疾病所攻击的靶标，是发病机制中重要的组成部分[14]。但由于胆管上皮细胞有限的数量和肝内的解剖位置限制了研究其分子功能的体外细胞模型的发展。获得正常和疾病源性的胆管上皮细胞并深入研究其生物学特性，对揭示胆管病的发病机制及其诊治大有裨益[15]。本研究重编程PSC患者皮肤成纤维细胞，获得疾病特异性的iPSCs细胞，在后续进一步向胆管细胞诱导分化后可用于研究疾病的发病机制、筛选治疗药物。