李 明， 谭诗云

武汉大学人民医院消化内科 消化系疾病湖北省重点实验室，湖北 武汉 430060

肿瘤间质是肿瘤赖以生存的环境，其在肿瘤细胞的增殖、迁移及分泌特性等方面起着重要作用。肿瘤间质由大量非肿瘤细胞构成，其中，成纤维细胞中的一个特殊群体被称为肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)，它是肿瘤间质内主要组成成分。研究表明，CAFs所分泌的一些因子(如促血管生成因子、基质金属蛋白酶、细胞因子等)在肿瘤的生长、血管生成、浸润和转移等过程中均发挥重要作用[1-2]。研究证实，COX-2在许多上皮性间质肿瘤如结直肠癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌及头颈部肿瘤等中过表达[3]，而作为前列腺素E2(PGE2)合成的限速酶，过表达的COX-2又可大量产生PGE2，二者共同参与细胞恶性转化、抑制细胞凋亡、促进肿瘤血管新生、抑制抗肿瘤免疫等机制调控[4-5]。CAFs在大肠癌增殖、侵袭中的作用研究较少，本研究首先将分离鉴定出的CAFs/NFs与大肠癌细胞系LoVo细胞建立共培养体系，观察CAFs对大肠癌细胞增殖、侵袭能力的影响，并探讨CAFs是否通过COX-2/PGE2通路促进大肠癌细胞增殖和侵袭。

1 材料与方法

1.1 主要材料大肠癌LoVo细胞由中国科学院上海细胞库提供，消化系疾病湖北省重点实验室冻存；主要试剂：丹皮酚购自宁波天真药业有限公司(纯度>98%)；胎牛血清购自GBICO；Transwell小室、培养板购于Corning公司；Matrigel胶购自BD公司；PGE2ELISA试剂盒购自美国BPB公司；COX-2、MMP-9、α-SMA、FAP及β-actin抗体购自Cell Signaling Technology公司。DMEM/F-12培养液、辣根酶标记山羊抗兔或山羊抗鼠IgG购自碧云天生物技术研究所。

1.2 临床标本选取武汉大学人民医院手术切除的大肠癌标本6例，同时选取>5 mm处癌旁病理证实为正常的大肠黏膜组织，患者术前均未接受放疗或化疗。所有标本的收集和使用均征得患者及其家属的知情同意，并签署知情同意书，并取得武汉大学人民医院医学伦理委员会批准。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养和实验分组：(1)大肠癌相关成纤维细胞(CAFs)和正常大肠成纤维细胞(NFs)分离、鉴定和培养：取材来自大肠癌手术切除的新鲜肿瘤组织及大肠正常组织(癌旁组织)，采用酶消化法进行成纤维细胞的原代培养，利用差异贴壁法进行成纤维细胞的纯化，利用免疫组化技术进行鉴定，检测α-SMA、FAP，细胞在质量浓度为100 g/L胎牛血清的DMEM/F-12培养基中培养。(2)大肠癌LoVo细胞培养：用质量浓度为100 g/L胎牛血清的DMEM/F-12培养基培养，置于37 ℃，体积分数为5%的CO2条件细胞培养箱中，取生长状态良好的并处于对数期的细胞进行实验。(3)实验分组：CAFs与大肠癌细胞共培养组(CAFs组)、NFs与大肠癌细胞共培养组(NFs组)、大肠癌细胞单独培养组(LoVo组)。

1.3.2 AFs与大肠癌细胞共培养体系的建立：(1)直接接触：选取对数生长期的大肠癌LoVo细胞，与CAFs(或NFs)分别以1∶1比例传代；(2)间接接触(Transwell法)：利用Transwell系统(0.4 μm孔径)，下层细胞为大肠癌细胞，上层为CAFs(或NFs)；

1.3.3 CCK8法检测细胞增殖能力：取3块24孔板，分别标记上12 h、24 h和48 h；取对数生长期的LoVo细胞，用质量浓度为100 g/L血清的DMEM/F-12培养基制成细胞悬液，用细胞计数板计数调整细胞浓度为2×104ml-1，接种于24孔板中，每孔600 μl细胞悬液，将浓度为2×104ml-1的CAFs(或NFs)加入对应的Transwell小室内(0.4 μm孔径)，每组设5个复孔，并设置空白对照组，37 ℃，体积分数为5%的CO2条件细胞培养箱中培养。于12 h、24 h和48 h取出培养板，每孔加入20 μl的CCK-8试剂，待培养液显色后，用酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光度值(A值)，根据公式计算细胞存活率(%)=(处理组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%，以细胞存活率表示细胞增殖情况。

1.3.4 Transwell法检测细胞侵袭能力：在4 ℃融化Matrigel胶，于冰上将Matrigel用磷酸盐缓冲液稀释后铺在小室内，室温放置10 min风干后备用；取对数生长期的LoVo细胞，用不含血清的培养基制成细胞悬液，用细胞计数板计数调整细胞浓度为2×104ml-1，接种于Transwell 在上室，每孔150 μl细胞悬液，下室中加入600 μl质量浓度为100 g/L的FBS血清培养基，或600 μl细胞浓度为2×104ml-1的CAFs(或NFs)，每组设5个复孔，置于细胞培养箱中培养24 h后取出小室，用PBS湿润的棉签轻轻拭小室内未迁移过膜的细胞；加入质量浓度为40 g/L多聚甲醛固定，室温10 min；再结晶紫染色，室温15 min；小心切下滤膜，用中性树胶封片；显微镜下观察并拍照计数穿过滤膜的细胞数，每个滤膜取5个随机视野计数，统计结果。

1.3.5 ELISA法检测PGE2：取对数生长期的大肠癌LoVo细胞，调整用细胞计数板计数调整细胞浓度为2×105ml-1，与CAFs(或NFs)分别以1∶1比例接种于6孔板中，置于细胞培养箱中培养24 h后取出，吸取培养基离心后将上清液移至高压消毒的EP管中备用。加入标准品至酶标板中，设置梯度，分别取各组上清液样品100 μl，加入至酶标板中，再分别将每孔加入酶标液50 μl，室温放置90 min。具体操作步骤根据试剂盒要求进行，根据标准品曲线计算样品中PGE2浓度。

1.3.6 Western blotting检测COX-2、MMP-9蛋白表达：取对数生长期的LoVo细胞，用质量浓度为100 g/L血清的DMEM/F-12培养基制成细胞悬液，用细胞计数板计数调整细胞浓度为2×104ml-1，接种于24孔板中，每孔600 μl细胞悬液，将浓度为2×104ml-1的CAFs(或NFs)加入对应的Transwell小室内(0.4 μm孔径)，37 ℃，体积分数为5%的CO2条件细胞培养箱中培养24 h后收集24孔板内细胞，预冷PBS液洗涤，加入预冷蛋白裂解液200 μl，4 ℃裂解30 min，置于冰上超声裂解；4 ℃，12 000 r/min离心10 min，小心吸取上清，移至高压消毒过的EP管中，分装后置于-80 ℃储存。采用BCA法测定蛋白质；取40 μg样品并加入等体积上样缓冲液，SDS-PAGE电泳，再转膜至PVDF膜，37 ℃条件下用质量浓度为50 g/L BSA封闭1 h，分别加入兔抗人COX-2和MMP-9抗体，4 ℃摇床上孵育过夜；次日TBST洗膜，再加入辣根酶标记的山羊抗兔二抗，37 ℃条件下孵育2 h，TBST洗膜，暗室曝光、显影、定影、拍照并分析结果。

1.4 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，所有计量数值进行正态性检验，均为正态分布，计量资料以均数±标准差表示，两样本间均数比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大肠癌患者分离的原代CAFs/NFs的分离与鉴定

大肠正常组织中分离出的NFs在光镜下呈梭形，细胞规则，大小一致，排列有一定的方向性；从大肠癌组织中分离出的CAFs形态不规则，排列紊乱，可见双核及多核细胞，细胞核可见凹陷或切迹某些区域呈无极性排列。与NFs相比，CAFs具有一些特异的表型，如高表达平滑肌激动蛋白-α(α-smooth-muscle actin，α-SMA)、成纤维细胞活化蛋白(fibroblast-activated protein，FAP)，因此本实验应用免疫组化对分离出的成纤维细胞进行鉴定，结果显示，FAP及α-SMA主要在胞质中表达，NFs中不表达或低表达，CAFs中FAP及α-SMA表达均强表达，呈阳性(见图1)。

2.2 CAFs对大肠癌细胞增殖能力的影响将LoVo细胞单独培养设为对照组，分别将LoVo细胞与NFs或CAFs建立共培养体系，分别培养12 h、24 h和48 h后检测细胞增殖情况，结果显示，在相同处理时间下(24 h和48 h)，CAFs组LoVo细胞增殖活性显著高于LoVo组和NFs组，差异有统计学意义(P<0.05)(见图2)。

图1 大肠CAFs和NFs中FAP及α-SMA表达情况 Fig 1 The expressions of FAP and α-SMA in primary cultured NFs/CAFs cells

图2 CAFs对大肠癌细胞增殖能力的影响 Fig 2 The effect of CAFs on the proliferation of LoVo cells in colorectal cancer

2.3 CAFs对大肠癌细胞侵袭能力的影响将LoVo细胞单独培养设为对照组，分别将LoVo细胞与NFs或CAFs建立共培养体系，培养24 h后检测细胞侵袭能力，结果显示，CAFs组穿过Trasnwell小室基底膜的细胞数显著高于LoVo组和NFs组，差异有统计学意义(P<0.05)(见图3)。

2.4 CAFs对大肠癌细胞MMP-9表达的影响将LoVo细胞单独培养设为对照组，分别将LoVo细胞与NFs或CAFs建立共培养体系，培养24 h后免疫印迹结果显示，与LoVo组比较，NFs组中LoVo细胞MMP-9表达无显著性改变，CAFs组LoVo细胞MMP-9表达上调(见图4)。

图3 CAFs对大肠癌细胞侵袭能力的影响 Fig 3 The effect of CAFs on the invasiveness of LoVo cells in colorectal cancer

图4 CAFs对大肠癌细胞MMP-9表达的影响 Fig 4 The effect of CAFs on the expression of MMP-9 in LoVo cells in colorectal cancer

2.5 CAFs对大肠癌细胞COX-2表达和PGE2合成的影响将LoVo细胞单独培养设为对照组，分别将LoVo细胞与NFs或CAFs建立共培养体系，培养24 h后免疫印迹结果显示，与LoVo组比较，NFs组中LoVo细胞COX-2表达无明显改变，而CAFs组LoVo细胞COX-2表达上调。同时，细胞上清液中PGE2含量在CAFs组中较LoVo组和NFs组升高，差异有统计学意义(P<0.05)(见图5)。

3 讨论

大肠癌是临床上常见的消化道恶性肿瘤，其死亡率高居肿瘤相关死亡的第2位[6-7]。尽管近些年在肿瘤研究特别是治疗方面取得了重大进步，但进展期大肠癌患者的预后仍较差。因此需进一步探讨大肠癌发生发展的机制，为大肠癌的临床治疗提供更多的理论依据。

图5 CAFs对大肠癌细胞COX-2表达和PGE2合成的影响 Fig 5 The effect of CAFs on the expressions of COX-2 and synthesis of PGE2in LoVo cells of colorectal cancer

肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)对肿瘤形态结构、生长方式及增殖活性、运动能力及分泌特性等方面的影响及作用正在被逐步认识，成为肿瘤研究的热点[8-10]。TME由肿瘤细胞及肿瘤间质构成。CAFs是肿瘤间质内主要组成成分。研究[11-13]表明，CAFs可分泌多种细胞因子或趋化因子包括TGF-β、HGF、SDF-1等通过各种信号通路参与肿瘤细胞生物学行为的调控，在肿瘤的生长、血管生成、浸润和转移等过程中均发挥重要作用。本研究应用Transwell系统建立了CAFs与大肠癌细胞共培养体系，CCK-8实验测结果发现，与CAFs共培养的大肠癌LoVo细胞增殖能力相对于LoVo组和NFs组显著增强。侵袭、转移是恶性肿瘤的主要特征，肿瘤细胞分泌的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)可通过降解细胞外基质并破坏基底膜，促进肿瘤细胞从原发灶向周围组织及远处转移。本实验发现，与LoVo组或NFs组比较，CAFs组穿过Trasnwell小室基底膜的LoVo细胞数量更多，且MMP-9表达上调，提示CAFs可促进大肠癌细胞的增殖、侵袭能力。

COX-2是前列腺素特别是PGE2合成过程的重要限速酶，二者共同参与细胞恶性转化、抑制细胞凋亡、促进肿瘤血管新生、抑制抗肿瘤免疫等机制调控。为进一步明确CAFs促进大肠癌细胞的增殖、侵袭能力的机制，本实验进一步探讨了大肠癌细胞COX-2表达和PGE2合成水平的变化，结果显示，与CAFs共培养的大肠癌LoVo细胞COX-2表达及细胞上清液中PGE2含量较LoVo组和NFs组显著升高。

综上所述，本实验结果发现，CAFs可能通过上调大肠癌细胞COX-2表达和PGE2合成促进大肠癌细胞的增殖、提高其侵袭能力。但CAFs如何调控大肠癌细胞COX-2/PGE2表达及体内是否可产生相同的作用等问题均有待我们进一步去探讨。