谢 扬， 张 竞， 喻 军， 王 凤， 齐 健

武汉大学中南医院消化内科 肠病湖北省重点实验室 湖北省肠病医学临床研究中心，湖北 武汉 430071

美国癌症协会2018年发布的癌症统计数据显示，肿瘤致死率居世界第二，仅次于由心血管疾病所致的死亡[1-2]。在美国，结直肠肿瘤的发病率和死亡率均位居第三，在男性和女性中的排名皆是如此[2]。在中国，结直肠肿瘤发病率在男性中排名第五，在女性中排名第四，每年有12 000例新增结直肠癌患者[3]。早期预防、检测和治疗对于结直肠肿瘤的控制和管理至关重要。虽然，目前在结直肠肿瘤的分子机制、诊断及治疗方面取得了重大进展，但结直肠肿瘤患者的5年生存率并无显著提高[4-6]。因此，迫切需要用非侵入性方法早期检测结直肠肿瘤用于预后管理。

核苷酸切除修复机制在维持染色体完整性方面起重要作用。任何干扰核苷酸切除修复机制的因素都会影响细胞的活动，甚至导致细胞死亡。因此正常功能状态下的核苷酸切除修复因子对细胞的分裂和分化显得尤为重要[7]。SNF2家族是一个重要的蛋白质家族，其功能作用同核苷酸切除修复因子一样，也是核糖体装配、翻译起始和细胞生长的关键因子。ERCC6是SNF2家族的成员之一，能够使DNA修复装置进入DNA链，在转录偶联DNA修复中起关键作用[7]。ERCC6在结直肠癌组织中表达上调，且ERCC6表达升高与化疗的不良反应及预后不良有关[8]。在小鼠中新发现的ERCC6L基因，也称为PICH(Polo样激酶相互作用蛋白“解旋酶”)，已被证明是SNF2家族中另一个与肿瘤发展相关的成员。NIELSEN等[9]发现，ERCC6L在有丝分裂过程中与拓扑异构酶Ⅱ协同作用，促进姐妹染色单体的分离。此外，ERCC6L作为DNA依赖的ATP酶，与PLK1相互作用，形成一个复杂的复合体，在前中期维持染色体的结构。研究[10]表明，ERCC6L并非一个典型的NER因子，而是在有丝分裂过程中姐妹染色单体的分离中发挥作用。

ERCC6L蛋白在细胞质中组装，然后进入细胞核发挥其功能，在小鼠胚胎期，尤其是胚胎发育期的脑、心、肾、肝和肺组织中表达较高。然而，ERCC6L基因的表达在出生后明显下调，且在大多数成体器官中均未检测到ERCC6L的表达[7]。最近的研究[11-12]表明，ERCC6L在多种人实体肿瘤中高表达，因此被认为是治疗癌症的新靶点。PU等[12]发现，ERCC6L mRNA在乳腺癌和肾癌进展过程中增加，且ERCC6L表达增加与总体生存率相关。此外，ERCC6L沉默抑制了癌细胞的增殖，提示ERCC6L可能是肿瘤进展的有效生物标记物。然而，ERCC6L在结直肠肿瘤中的作用尚无相关研究。

本研究首先采用GEPIA和UALCAN数据库分析ERCC6L在结直肠肿瘤组织中基因表达情况，然后通过qRT-PCR、Western blotting和免疫组织化学检测方法验证ERCC6L在结直肠肿瘤组织和细胞中的表达，并探讨ERCC6L基因在结直肠肿瘤细胞中对增殖和侵袭的作用。

1 材料与方法

1.1 GEPIA和UALCAN数据库GEPIA分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)是由北京大学研制开发可用于分析基因在癌症和正常组织的差异表达的在线应用。UALCAN是另外一个TCGA数据库数据挖掘网站(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)，可用来分析单个或多个基因在肿瘤中的表达与预后的关系。本研究利用这两个在线分析网站分析ERCC6L在结直肠肿瘤中的表达水平。

1.2 组织标本本研究所用样本来自武汉大学中南医院结直肠外科收治的原发性结直肠肿瘤组织，共30例。在病灶和距离病灶2 cm处各取组织大小为1 cm×1 cm×1 cm样本，即为癌和癌旁组织。所有患者在纳入该研究前均已获得知情同意。这项研究已得到武汉大学中南医院伦理委员会机构的批准，并按照“赫尔辛基宣言”的道德准则进行。所有患者术前未进行化疗和放疗，其诊断均经组织病理学证实为结直肠癌。

1.3 细胞培养本研究所用的结直肠肿瘤细胞系(HCT116、SW480、HT29)和正常结直肠黏膜上皮细胞系(NCM 460)均来自中国科学院(上海)细胞库。所用细胞培养基为高糖培养基(DMEM)，质量浓度为100 g/L的胎牛血清和质量浓度为10 g/L的双抗体(青霉素/链霉素)，并培养在37 ℃，体积分数为5%的CO2培养箱中。

1.4 RNA干扰与转染本实验中使用的ERCC6L(siRNA-ERCC6L)和阴性对照(si-NC)的小干扰RNA(siRNA)序列购自锐博生物(中国广州)。siRNA序列如下：si-ERCC6L-101(sense：5′-GCAGGCTGCTCAT-TACCTA-3′，anti-sense：5′-TAGGTAATGAGCAGCCTGC-3′)；si-ERCC6L-102(sense：5′-GTAGGTGGTGTCGGTT-TAA-3′，anti-sense：5′-TTAAACCGACACCACCTAC-3′)；si-ERCC6L-103(sense：5′-GCTGGTTAATGACGTCTAA-3′，anti-sense：5′-TTAGACGTCATTAACCAGC-3′)；NC(sense：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，anti-sense：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)。将结直肠肿瘤细胞置于6孔板(50 000 ml-1)中培养，当细胞密度为50%～60%时开始转染。根据制造商提供的实验步骤，使用转染试剂(GenMuteTMsiRNA)siRNA转染细胞，24 h后，收集细胞进行实验分析。

1.5 RNA提取与实时定量PCR(qRT-PCR)将收集的结直肠肿瘤组织(0.5 cm)放置在含有1 ml TRIzol试剂的EP管中(LifeTechnologies，美国)，然后用组织研磨器研磨。总RNA提取按照制造商的步骤进行，提取的RNA用无酶水溶解，并立即储存在-80 ℃。用NanoDrop 2000测定RNA浓度，然后用逆转录试剂盒(Toyobo，日本)合成cDNA，用Biorad 7500进行qRT-PCR。ERCC6L和GAPDH的qRT-PCR引物购自中国武汉擎科。所使用的特异引物如下：ERCC6L(forward：5′-ATCGGTGCCTCAGCGTTCGG-3′；reverse：5′-CTGTCCTCGCCGTCACACCG-3′)；GAPDH (forward：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′；reverse：5′-GCAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′)GAPDH为内参。上述实验重复3次，结果转换为2-ΔΔCT进行分析。

1.6 Western blotting用RIPA蛋白提取试剂(碧云天，北京)和质量浓度为10 g/L苯甲基磺酰氟(PMSF，武汉)对结直肠肿瘤组织和细胞进行裂解。用改良的BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度(碧云天，北京)。每条泳道含有等量的蛋白质(30 μg)，用质量浓度为80 g/L的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，并将其转移到PVDF膜上。在室温下用质量浓度为50 g/L牛奶封膜2 h，然后将膜置于含抗ERCC6L抗体的TBST溶液中(1∶1 000；San Ying Biotechnology，BC008808)，在4 ℃条件下孵育约12 h。第2天，用TBST洗涤后，用HRP标记的抗兔抗体(1∶5 000，GB233303-1，赛维尔，中国)在室温下孵育2 h。用ECL检测试剂进行可视化观察，每组重复3次。

1.7 细胞增殖实验将细胞按3 000个/孔置于96孔板中培养，并进行转染，分别培养0、24、48、72和96 h，每天取出一块避光加入10 μl CCK8，孵育2 h后，酶标仪检测每个孔在450 nm处的吸光度值(OD值)，并重复3次。

1.8 细胞侵袭实验采用24孔板(BD Biosciences，Bedford，MA，USA)，其中含有8.0 μm孔径人工基底膜的小室，用于细胞侵袭实验。在无血清培养基中，将1×105细胞接种到含有基质胶的人工基底膜小室上腔内。24孔板中加入质量浓度为200 g/L血清的高糖培养基600 μl作为化学引诱剂。37 ℃孵育24 h后，用湿棉签轻拭腔室上方的非侵入性细胞，以质量浓度为40 g/L的多聚甲醛固定30 min，质量浓度为1 g/L结晶紫染色20 min，在光学显微镜下计数，以上实验重复3次。

1.9 免疫组织化学将结直肠肿瘤组织固定在质量浓度为100 g/L中性甲醛溶液中，然后用石蜡包埋进行免疫组化切片制作，在光学显微镜下观察图像，进行统计学分析。

2 结果

2.1 GEPIA和UALCAN数据库分析ERCC6L在结直肠肿瘤组织中的表达在GEPIA数据库中输入ERCC6L，并选择结直肠肿瘤，得到图1A，同样方法在UALCAN数据库中得到图1B，ERCC6L在结直肠肿瘤组织中的表达明显高于癌旁组织(P<0.05)。

图1 ERCC6L在结直肠肿瘤组织中的表达情况 Fig 1 Expression of ERCC6L in colorectal tumor tissues

2.2 ERCC6L在结直肠肿瘤组织和细胞中mRNA和蛋白水平的表达情况采用qRT-PCR和Western blotting方法检测了30对结直肠肿瘤及其癌旁组织中ERCC6L的表达(见图2A、2C)；以同样方法在正常结直肠上皮黏膜细胞系(NCM 460)和3株结直肠肿瘤细胞系(HT29、SW480、HCT116)验证ERCC6L的表达(见图2B、2D)。ERCC6L在结直肠肿瘤组织和细胞中表达均高于癌旁组织和正常细胞(见图2)。

免疫组织化学染色显示,ERCC6L蛋白在结直肠肿瘤组织细胞的胞浆和胞核中均有表达，且其表达高于癌旁(见图3，P<0.05)。

2.3 筛选组织ERCC6L最佳干扰序列选择ERCC6L表达较高的SW480和HT29细胞系用于后续实验，首先用3种不同的siRNA阻断ERCC6L的表达后，用qRT-PCR方法检测3种siRNAs的干扰效率(见图4A、4B)，si-ERCC6L-103的干扰效果最佳，接着我们又用Western blotting方法验证了其在蛋白水平干扰效果(见图4C、4D)，因此我们选择si-ERCC6L-103用于后续实验。

2.4 ERCC6L基因对结直肠肿瘤细胞增殖的影响分别用si-ERCC6L-103和对照(siRNA-NC)处理SW480和HT29细胞系，用CCK8法测定细胞活力。两种细胞中干扰ERCC6L基因后对结直肠肿瘤细胞的增殖有明显的抑制作用(见图5)。

2.5 ERCC6L基因对结直肠肿瘤细胞侵袭的影响用Transwell试验检测ERCC6L对结直肠肿瘤细胞侵袭能力的影响，与对照组相比，SW480和HT29细胞在干扰ERCC6L基因后侵袭细胞的数量显著减少(见图6)。

图2 ERCC6L在结直肠肿瘤组织和细胞系中mRNA和蛋白水平的表达情况 Fig 2 Expression levels of ERCC6L mRNA and protein in colorectal tumor tissues and cell lines

图3 结直肠肿瘤组织和癌旁组织中ERCC6L的蛋白表达情况(200×) Fig 3 Expression of ERCC6L protein in colorectal tumor and adjacent tissues (200×)

图4 三种siRNA序列在SW480和HT29细胞系中的干扰效率 Fig 4 Interference efficiency of 3 siRNA sequences in SW480 and HT29 cell lines

图5 干扰ERCC6L基因对结直肠肿瘤细胞增殖的影响 Fig 5 Effect of interference with ERCC6L gene on proliferation of colorectal tumor cell lines

图6 ERCC6L基因对结直肠肿瘤细胞侵袭的影响(200×) Fig 6 Effect of ERCC6L gene on invasion of colorectal tumor cell lines (200×)

3 讨论

结直肠肿瘤是一种复杂、多步骤的疾病，具有多种遗传改变。最近，有几种蛋白质被描述为肿瘤生物标记物，有助于鉴别结直肠肿瘤，如AKAP4[13]、XBP-1[14]和SLC38A1[15]。然而，一个生物标记物不太可能识别所有的结直肠肿瘤，因此，必须确定更多的治疗靶点和可靠的预后生物标记物，以提高对结直肠肿瘤患者的诊断和治疗水平。

ERCC6作为SWI/SNF相关ATP酶家族的成员，与许多疾病有关[16-17]。据报道Cockayne综合征和脑-眼-骨骼综合征是由ERCC6基因突变引起的[18-20]。此外，ERCC6基因多态性可为膀胱癌患者提供早期诊断、精确治疗，同时改善临床预后和生活质量[21]。ERCC6L是SNF2家族中另一个与发展相关的成员，与ERCC6相比具有不同的功能和作用。许多研究已经探讨了干扰ERCC6L功能后对细胞染色体结构和稳定性的影响。例如，在人类癌细胞中沉默ERCC6L基因会导致染色体臂中PLK1的丢失和染色体异常(如染色质桥和微核的增加)[21-25]。此外，研究发现，PLK1在细胞凋亡、细胞周期和细胞增殖[23,26-28]等生物学过程中起着重要的调节作用，这些发现揭示了ERCC6L调节细胞生物学功能的潜在机制。

本研究中，我们采用定量qRT-PCR和Western blotting方法检测结直肠肿瘤组织和细胞系中ERCC6L mRNA和蛋白水平的表达。此外，我们用免疫组织化学方法检测了ERCC6L蛋白在结直肠癌组织中的表达。结果表明，ERCC6L在结直肠肿瘤中的表达明显增加，提示ERCC6L可能在结直肠肿瘤的发生、发展中起重要作用。此外，我们用小干扰RNA降低ERCC6L的表达，探讨ERCC6L在结直肠肿瘤中对增殖和侵袭的影响。结果表明，干扰ERCC6L基因导致结直肠肿瘤细胞增殖减弱和侵袭能力降低。本研究证明了ERCC6L在结直肠肿瘤发展中起重要作用，ERCC6L可能是结直肠肿瘤一个新的生物标记物和治疗靶点。今后的研究应致力于探究ERCC6L在结直肠肿瘤中的作用机制及其调节的信号通路。