孙志艺，张 茹，赵丽萍，王彦多，刘金虎，李梓欣，史 磊

(山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355)

全蝎为钳蝎科东亚钳蝎的干燥体，据临床报道，全蝎对于治疗肺癌、喉癌、食管癌、乳房肿瘤等多种癌肿有较好的疗效，中国古代中医文献例如宋朝《开宝本草》、明朝《本草纲目》等也多处记载全蝎药用价值极高[2]。焦方文[3]等人通过对全蝎酶解工艺研究发现胰蛋白酶、胰凝蛋白酶和弹性蛋白酶作用较佳。张盼盼[1]等人发现全蝎酶解液80%乙醇沉淀物>10kDa分子量段对肺腺癌A549抑制率较高。Fangwen Jiao[4]等人发现酶解3h，pH值8.5，酶量2000U条件下全蝎酶解效果较好。本文通过优化后酶解工艺得到全蝎复合酶酶解液，通过超滤选取>10kDa分子量段全蝎酶解液超滤物，对三种癌细胞体外抗肿瘤活性结果进行比较，为进一步研究全蝎酶解物超滤物的抗肿瘤作用奠定基础。

1 材料

1.1 药材

新鲜野生全蝎(购于山东沂源)经山东中医药大学中药鉴定学教研室李峰教授鉴定为东亚钳蝎，选择成年钳蝎，洗净后-20℃冷冻过夜，低温匀浆后冷冻干燥成粉末备用。

1.2 仪器与试药

KQ-500E型超声波提取器(昆山市超声仪器有限公司)；LGJ-18A型冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂有限公司)；WT600-2J型超滤仪(上海摩速科学器材有限公司)； 生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司)；TD5M 型台式离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)；2D2X-50FBS立式压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)； BBD6 型二氧化碳培养箱(Thermo Scientific)； MK3 型酶标仪(Thermo Scientific)；CKX41型倒置显微镜(Olympus)；牛血清蛋白(BR)； 1640 细胞培养基(Hylcone-赛默飞世尔生物制品北京有限公司)；Folin-酚试剂(国药集团化学试剂有限公司)；胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶(上海源叶生物科技有限公司)；MTT；DMSO等。喉癌Hep-2、肺腺癌A549、乳腺癌MCF-7由山东省立医院提供。

2 方法

2.1 全蝎酶解液超滤物提取

根据张盼盼[1]等人得提取方法制备酶解液，用0.8微米滤膜过滤，通过10kDa滤膜超滤得到>10kDa分子量段的物质，冷冻干燥备用。

2.2 细胞培养(肺腺癌A549、喉癌Hep-2、乳腺癌MCF-7)

2.2.1 细胞复苏

从液氮罐中将三种冻存的肿瘤细胞取出，分别将其放置于37 ℃ 的水浴锅中融化。进行消毒，然后将其带入超净台中，取出细胞，以1000 r/min进行离心。之后向离心管中加入1640 培养基(A549细胞采用DMEM培养基)，通过吹打使其混合均匀，随后将其转移至培养瓶中，添加适量的1640培养基，放置24 h 换液。

2.2.2 细胞传代

待细胞增殖至90 %左右时，进行细胞传代。首先用PBS缓冲溶液将其清洗三次，再加入500μL 0.25 % 的胰蛋白酶溶液消化。将培养瓶放置于超净台中，静置一段时间，待细胞为蜷缩不贴壁后加入1640培养基，轻轻吹打，吹散成单细胞悬液状态，将细胞分装至培养瓶中。最后放置于含5% CO2、适宜湿度、温度为37 ℃的培养箱中培养，并于24 h 后换液。

2.3 抑制率测定(MTT法)

2.3.1 提取物溶液配制

精密称取质量为10.00 mg的全蝎复合酶酶解液>10KDa分子量段超滤物冻干粉，并溶解于5 mL的1640培养基中，配成含冻干粉2 mg/mL的初始浓度，在超净台中用0.22μmL的滤膜过滤，然后通过1640培养基依次进行稀释，配成2，1.6，1.2，0.8，0.4mg/mL的药物浓度。

2.3.2 抑瘤实验方法

分别将处于对数生长期的乳腺癌CMF-7、肺腺癌A549、喉癌Hep-2细胞消化后稀释成1×106个/mL的肿瘤细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔接种100μL，放置于5 % CO2、37 ℃的培养箱中培养。培养24 h之后将培养基弃掉，在空白对照组中加入100μL不含血清的1640培养基，在阳性对照组中加入100 μL 浓度为100μg/mL的顺铂，其他给药组每孔分别加入100μL不同浓度的药物，每种浓度的药物分别重复加入5个孔中。之后将细胞放入含5 % CO2温度为37 ℃的培养箱中继续培养。等待24 h后，每孔加入20μL 浓度为5 mg/mL的 MTT溶液，将其放回培养箱中避光反应4 h。最后去除上清液，加入100μL DMSO，使用酶标仪在492nm波长处测定OD值，按下式计算出药物对三种细胞的抑制率。

3 结果

MTT法测定三种癌细胞的抑制率。五种浓度的全蝎酶解液超滤物对三种癌细胞(Hep-2、A549、MCF-7)抑制率柱状图及三种细胞抑制率对比折线图见图1、图2、图3、图4。

图1 不同浓度酶解超滤物对喉癌Hep-2的抑制率

由图1知，在0.4mg/mL的浓度下，药物对喉癌Hep-2的增殖无抑制作用，从0.8mg/mL浓度开始，药物对喉癌Hep-2的抑制率均大于60%，对细胞的生长有明显的抑制作用。

图2 不同浓度酶解超滤物对肺腺癌A549的抑制率

由图2知，在低浓度0.4mg/mL以及0.8mg/mL下，药物对肺腺癌A549的增殖无抑制作用，从1.2mg/mL浓度开始，药物对肺腺癌A549的抑制率均大于50%且成良好的线性关系，对细胞的生长具有明显的抑制作用。

图3 不同浓度酶解超滤物对乳腺癌MCF-7的抑制率

由图3知，在0.4mg/mL浓度下，药物对乳腺癌MCF-7的增殖无抑制作用，从0.8mg/mL开始，药物对乳腺癌MCF-7的抑制率均大于80%，在1.2mg/mL浓度时达到最高值99%，从1.6mg/mL浓度开始，药物对乳腺癌MCF-7的抑制率出现下降趋势，但从实验数据分析，药物对乳腺癌MCF-7的生长有明显的抑制作用。

图4 三种细胞抑制率对比

由图4知，在0.4mg/mL浓度下，药物对三种细胞的增殖均无抑制作用，从1.2mg/mL浓度开始，药物对三种细胞生长的抑制率均大于50%，药物对三种癌细胞均有明显的抑制作用，药物对喉癌Hep-2的抑制作用强于对肺腺癌A549的抑制作用。

综上，药物在浓度较低时对癌细胞增殖无抑制作用，药物浓度较高时对三种癌细胞增殖均有较好的抑制作用。在此实验浓度梯度内，药物对喉癌Hep-2、肺腺癌A549细胞增值的抑制作用随药物浓度升高而增强，药物对乳腺癌MCF-7细胞增值的抑制作用随药物浓度的增高呈现先增强后下降的趋势，喉癌Hep-2、肺腺癌A549细胞实验IC50分别为0.69mg/mL和1.162mg/mL，因此药物对喉癌Hep-2的抑制作用比对肺腺癌A549的抑制作用强。

4 讨论

全蝎具有抗肿瘤、抗凝、抑菌等作用，药用价值高，历史悠久，提取方法从最初的水提到现在的酶解、发酵，不同提取方法所发挥的药理作用有所差距，人们不断去深化其对某一病症的探索，进而希望能够靶向治疗。

FangwenJiao[4]等人通过正交实验得到较优化的全蝎酶解方法，因此本实验采用其探究的最优酶解工艺进行酶解。由王燕平[6]等人研究可知全蝎含有蛋白质、多糖、甜菜碱等多种复杂成分，本实验在低浓度药物下细胞增长抑制率出现负数，可能与全蝎复杂的成分有关。通过酶解可在温和的条件下，提高蛋白的收率[7]，由张盼盼[1]等人研究可知全蝎酶解液醇沉后蛋白含量较高，且对肺腺癌A549的生长有抑制作用，本实验证明全蝎复合酶酶解液>10KDa分子量段超滤物对肺腺癌A549、喉癌Hep-2、乳腺癌MCF-7均有明显抑制作用，与其结果基本一致。又由焦方文[8]等人研究全蝎酶解物种多糖含量为13.84%，多糖作为一种增强机体免疫力、降血、抗肿瘤等的生物活性成分，在提取过程中，通过酶解的方法可以大大提高多糖浸出率，可进一步研究全蝎酶解物中多糖的作用。本实验数据表明药物对喉癌Hep-2的抑制作用比对肺腺癌A549的抑制作用强，为全蝎酶解液超滤物抗肿瘤作用的进一步深入研究提供新思路。