刘莹莹， 曲甜甜， 张丹雨， 卜 宁

(沈阳师范大学， 辽宁 沈阳 110034)

土地荒漠化是我国乃至世界上最严重的生态环境灾难。遏制和治理土地沙化，改善生态条件，维持并扩大人类的生存空间，实现经济可持续发展已成为亟需解决的重要问题。目前，土壤荒漠化治理的方法中，微生物菌肥因具有诸多优势而成为重要研究方向[1]。微生物是土壤生态系统中物质循环和能量流动的重要组成成分，而土壤中的芽孢杆菌(Bacillus)是一类重要的植物根际促生菌(plant growth Promoting rhizobacteria，PGPR)，因其具有较强抗逆性等生物学功能而成为生物菌肥研制和生物农药开发的潜质菌源。笔者以从蒙辽交界沙化土壤中分离出2株芽孢杆菌STW-2和STW-64为菌源，前期研究鉴定STW-2为阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)；STW-64为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，测定菌株对植物病原菌的拮抗活性，并对菌株的发酵条件进行优化，以期为蒙辽交错带破碎化草地的植被恢复提供生物菌肥和生物农药的研发菌源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试供菌株 试供芽孢杆菌：菌株SWT-2(阿氏芽孢杆菌Bacillusaryabhattai)和SWT-64(巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium)，均分离自蒙辽交界阜新彰武县章古台镇的沙化土壤，由沈阳师范大学生命科学学院微生物实验室提供。

植物病原真菌：玉米大斑病菌(Cornnorthernleafblight)、玉米弯孢叶斑病菌(CurvularialunataBoed)、玉米顶腐病菌(Pythiumspp)、玉米圆斑病菌(Drechsleracarbonum)、玉米穗腐菌(Maizeearrot)、玉米黑束菌〔Ustilagomaydis(DC)Corola〕、番茄灰霉病菌(botrytiscinerea)、苹果霉心病-粉红聚端孢菌(Applemoldycore)、辣椒疫霉病菌(phytophthoracapsici)、黄瓜花腐病菌(Stemrotofcucumber)、黄色链孢菌(HuangSelianPestalotiopsis)、甜瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、高粱靶斑病菌(LeafSpotinSorghum)、向日葵核盘菌(SunflowerSclerotiniasclerotiorum)，均由沈阳师范大学生命科学学院微生物实验室提供。

1.1.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、水1 000 mL、pH 7.0～7.2；PDA培养基(培养指示真菌)：土豆200 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL、自然pH。

1.2 对植物病原菌的拮抗活性测定

分别将已活化的2株试供芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，26℃、120 r/min发酵24 h，备用。用直径为5 mm的滤纸片蘸取供试芽孢杆菌发酵液放置于新PDA平板中央。将已活化的植物病原指示菌分别接种于PDA平板培养基上，26℃培养7 d，在菌落边缘选取直径5 mm的菌饼，在距离滤纸片2 cm处等距离处放置3个植物病原菌菌饼，每个处理3次重复，以未接供试芽孢杆菌(无菌水)的处理为对照。接菌后26℃培养5 d，测量抑菌圈大小，计算抑菌率。抑菌率(%)=[r1-(d-r2)]/r1×100，其中，r1为两病原菌心间距离，r2为菌心到病原菌垂直距离，d为菌心到病原菌心间距离。

1.3 菌株不同发酵条件的优化

1.3.1 培养时间 将2 株供试芽孢杆菌分别接种于牛肉膏蛋白胨培养液中，26℃、120 r/min培养18 h制备种子培养液，备用。以5%接种量将2供试芽孢杆菌种子培养液分别接种于含有50 mL牛肉膏蛋白胨培养液的150 mL三角瓶中，26℃、120 r/min培养，分别在0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、90 h、102 h测定培养液的OD600值，以未接菌的牛肉膏蛋白胨培养液为空白对照，每个处理3次重复。以培养时间为横坐标，以OD600为纵坐标绘制菌株生长曲线。

1.3.2 碳、氮源 最佳碳源：以不含碳源的牛肉膏蛋白胨培养液为基础，分别加入葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、麦芽糖，以不加碳源的培养基为对照，分别接种1%的供试芽孢杆菌种子培养液，26℃、120 r/min培养16 h，测定培养液的OD600值，每个处理3次重复。最佳氮源：以不含氮源的牛肉膏蛋白胨培养液为基础，分别加入蛋白胨、酵母浸粉、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵，以不加氮源的培养基为对照，分别接种1%的供试芽孢杆菌种子培养液，26℃、120 r/min培养16 h，测定培养液的OD600值，每个处理3次重复。

1.3.3 无机盐 以牛肉膏蛋白胨培养液为基础，分别加入CaCO3、KH2PO4、NaCl、MgSO4，以不加无机盐的培养基为对照，分别接种1%的供试芽孢杆菌种子培养液，26℃、120 r/min培养16 h，测定培养液的OD600值，每个处理3次重复。

1.3.4 初始NaCl浓度 以牛肉膏蛋白胨培养液为基础，在含有0、0.5%、1%、1.5%、2%、3%、5%NaCl的培养液中分别接种1%的供试芽孢杆菌种子培养液，26℃、120 r/min培养16 h，测定培养液的OD600值，每个处理3次重复。

1.3.5 初始pH 以牛肉膏蛋白胨培养液为基础，在初始pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12培养液中分别接种1%的供试芽孢杆菌种子培养液，26℃、120 r/min培养16 h，测定培养液的OD600值，每个处理3次重复。

1.3.6 正交试验 以蔗糖为碳源、蛋白胨和酵母浸粉2个相近氮源、KH2PO4、pH作STW-2菌株的5因素4水平正交试验；以葡萄糖为碳源、蛋白胨和酵母浸粉2个相近氮源、KH2PO4、pH作STW-64菌株的5因素4水平正交试验，以确定2个菌株最优发酵条件。

2 结果与分析

2.1 菌株对植物病原菌抑菌活性

由表1可知，SWT-2菌株对苹果霉心病菌、辣椒疫霉菌、黄色链孢菌、玉米穗腐菌、玉米圆斑菌5种植物病原菌具有抑菌活性；STW-64菌株对甜瓜枯萎病菌、苹果霉心病菌、辣椒疫霉菌、黄色链孢菌、玉米穗腐菌、玉米圆斑菌6种植物病原菌有抑菌活性。STW-2、STW-64菌株的抑菌率均在35%以上，其中两者对苹果霉心病-粉心聚端孢(Applemoldycore)的拮抗活性最高，抑菌率分别为63.2%和64.2%。

表1 2株芽孢杆菌对植物病原菌的抑菌活性

注：表中数据为3 次重复的平均值。

Note: The data in the table were the average values of 3 replicates.

2.2 菌株的优化发酵条件

2.2.1 培养时间 由图1可见，随培养时间的增加，培养液的OD600值呈先升高后降低趋势，菌株STW-2的OD600值在0～24 h内随培养时间的增加而加大，菌数呈指数增长，在24 h时达到最大；24 h以后，OD600值随培养时间的增加而减少，直至菌数不再增加，整个群体生长进入稳定期、衰亡期。菌株STW-64的OD600值在0～48 h内随培养时间的增加而加大，菌数呈指数增长，在48 h时达到最大；48 h以后，OD600值随培养时间的增加而减少，直至菌数不再增加，整个群体生长进入稳定期、衰亡期。

2.2.2 碳、氮源 从图2可看出，STW-2菌株在以蔗糖为碳源时，菌株生长最好，且显著高于其他碳源；以酵母浸粉为氮源时，生长最好，且显著高于其他氮源。STW-64菌株在以葡萄糖为碳源时，菌株生长最好，以蛋白胨为氮源时，菌株生长最好。

图2不同碳、氮源处理菌株的OD值

2.2.3 无机盐 由图3可见，氯化钠对STW-2菌株的生长无显著影响，而另外3种因素可显著抑制其生长；对于菌株STW-64来说，氯化钠和硫酸镁能够显著促进其生长，碳酸钙则显著抑制其生长，磷酸氢二钾对其无显著影响。2株菌株均在NaCl为无机盐的培养基中生长最好。

图3不同无机盐处理菌株的OD值

Fig.3 OD values of strains treated with different inorganic salts

2.2.4 初始NaCl浓度 由图4所示，培养基中NaCl浓度对菌株生长有显著影响。在盐浓度小于3%时，STW-2和STW-64菌株的生长量随着盐浓度的变化而保持稳定，盐浓度增加到5%时，生长量显著下降，说明2种菌株生长受到影响，耐盐的最大值为3%左右。

2.2.5 初始pH 由图5可知，pH为4～5时，2株菌的菌体数量随着初始pH的增大而加大，菌数呈指数增长，pH为6时达到最大；pH 为9～12时，2株菌的菌体数量随着初始pH的增大而减少。

2.2.6 正交试验 由表2可见，STW-2菌株发酵条件优化的影响因素，由R值得出碳源(葡萄糖)>pH>缓冲物质(磷酸二氢钾)>氮源(蛋白胨)>氮源(酵母浸粉)；由K值可知：碳源的最适浓度为A3，最适pH为F3即为7，磷酸二氢钾的最适浓度为D2，蛋白胨的最佳浓度为B2，酵母浸粉的最适浓度为C4。则STW-2菌株发酵培养基最好水平组合为A3B2C4D2E3，即：蔗糖0.3%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉1.5%，磷酸二氢钾0.5%，pH为7。STW-64菌株发酵条件优化的影响因素，由R值得出pH>缓冲物质(磷酸二氢钾)>碳源(葡萄糖)>氮源(酵母浸粉)>氮源(蛋白胨)；由K值可知：碳源的最适浓度为A3，最适pH为F3即为7，磷酸二氢钾的最适浓度为D2，蛋白胨的最佳浓度为B2，酵母浸粉的最适浓度为C3。则STW-64菌株发酵培养基最好水平组合为A3B2C4D2E3，即：葡萄糖0.3%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉1.0%，磷酸二氢钾0.5%，pH为7。

表2 STW-2与STW-64菌株菌株的正交试验结果

3 结论与讨论

以菌抑菌的生物防治方法不污染环境具有广阔前景。芽孢杆菌是植物病害生防微生物的重要组成部分，具有显著的生防潜力，能产生耐热抗逆的芽孢，利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中存活、定殖与繁殖[2]。目前用于生物防治的高效拮抗菌主要有芽孢杆菌类的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、多 粘 芽 孢 杆 菌(Paenibacilluspolymyxa)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)和短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)[3]。巨大芽孢杆菌是一种常见的多功能微生物，在土壤解磷、农药降解、污水处理及生物堆肥等领域均有应用[4-5]。许爱玲等[6]采用平板对峙培养法测定了地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌对棉花枯萎病菌和黄萎病菌均有明显抑制作用；孙龙生等[7]对巨大芽孢杆菌BM1259的抑菌活性测定及体内拮抗试验表明，巨大芽孢杆菌能显著降低异育银鲫肠道气单胞菌的数量，提示巨大芽孢杆菌可作为潜在的水产专用微生态制剂。2009年，印度海德拉巴国家研究所发射带低温采样器的热气球，分离出20～41 km平流层中芽孢杆菌新种，将其以印度天文学家阿耶波多的名字命名为阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)，简称阿氏芽孢杆菌[8]。阿氏芽孢杆菌J-6具有对人、畜、农作物安全和环境友好的特点，对烟草黑胫病防治有显著效果[9]。从苜蓿根际分离出主要的株芽孢杆菌均能拮抗2种及以上供试植物病原真菌，同时具有不同程度的促生作用[10]。

研究的2株菌株通过平板对峙法检测菌株对植物病原菌的抑菌情况，结果发现STW-2、STW-64菌株分别对5种和6种植物病原真菌具有明显的拮抗活性，抑菌率均在49%以上，其中对苹果霉心病-粉心聚端孢(Applemoldycore)的拮抗活性最高，抑菌率分别为63.2%和64.2%；这与许爱玲等[6]的研究结果相似，表明巨大芽孢杆菌和阿氏芽孢杆菌均有抑制植物病原菌生长的能力，均有生物防治有益菌的潜力，但未进行菌株提高抑菌能力的培养条件优化，此方面还有待后续深入研究，提高这2株芽孢杆菌的生物防治能力是关键。

发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。单因素试验搭配正交试验是培养基优化的一般方法。刘露等[11]通过单因素试验优化巨大芽孢杆菌BM05的发酵条件，提高其发酵活菌数。王继雯等[12]为了提高巨大芽孢杆菌C2产芽孢的形成率，采用单因素和正交试验，通过摇瓶发酵培养，对影响巨大芽孢杆菌C2芽孢形成的发酵培养基成分和培养条件进行优化。该研究同样采用单因素试验与正交试验结合的方法，优化2株芽孢杆菌的培养基，结果表明STW-2的最优培养基配方为蔗糖0.3%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉1.5%，磷酸二氢钾0.5%，pH为7，26℃，120 r/min；STW-64的最优培养基配方为葡萄糖0.3%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉1.0%，磷酸二氢钾0.5%，pH为7，26℃，120 r/min。为以后菌株投入工业化生产打下基础。2株菌具有巨大的生物肥料、生物防治潜质并且有望在农业可持续发展中发挥促进作用，并对改善当地沙土地环境的有积极意义。