唐远江， 余 波， 刘 镜， 周思璇， 张 涛， 卢昱希

(1.贵州省农业科学院 畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005；2.贵州宏宇畜牧技术发展有限公司，贵州 贵阳 550005)

地榆(SanguisorbaofficinalisL)是蔷薇科(Rosaceae)地榆属(SanguisorbaLinn)植物，多年生草本，高30～120 cm，中生植物[1]。地榆的花、茎叶、根分别含有多种化学成分。槲皮素、山奈素苷、熊果酸、维生素等是茎叶的主要成分；花中主要含矢车菊苷、矢车双菊苷、杨梅苷、花青苷、无色花青苷黄酮醇以及儿茶素等；根中有鞣质(17%)和三萜皂苷(2.4%～4.0%)，还有黄酮、蒽醌、甾体类等化学成分[2]。俞浩等[3-4]研究表明，地榆中的鞣质具有止血作用。体外抑菌试验表明，地榆能有效抑制溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、枯草杆菌的生长[5]，地榆水提取液及醇提取液能明显抑制正常大鼠甲醛性足肿胀，具有一定的抗炎消肿作用[6]。相比抗生素，中药具有无残留、不易产生耐药性、价格便宜等优点，在畜牧养殖中的作用日趋重要[7]。《中国兽药典》2015版第2部中规定没食子酸为地榆的主要成分[8]，文献报道多采用酸水煎煮或回流提取植物中的没食子酸[9-11]，而关于地榆没食子酸的提取和生产报道较少，仅蓝海等[12]采用醇提取紫苏地榆没食子酸。因此，为拓展地榆没食子酸的提取方法，笔者等运用Plackett-Burnman(PBD)设计和Box-Behnken-响应面法(BBD)，优化建立安全、稳定的地榆没食子酸的提取工艺，以期为该中药的开发和利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品及试剂 地榆分析样品，购自四川千方中药饮片有限公司，批号20110301，产地四川；没食子酸对照品，购于中国食品药品检定研究院，批号110765-201308；其他试剂为色谱纯或分析纯。

1.1.2 仪器 LC-20型岛津高效液相色谱仪，日本岛津公司；HH-4数显恒温水浴锅，成都美普达仪器有限公司；BSA224S型电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；洁拓超声波清洗仪，深圳市洁拓超声清洗设备有限公司；DHG-9240A电热恒温干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司；RE-5205型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；多功能提取罐，成都永泰化工机械厂；真空浓缩回收器，成都永泰化工机械厂。

1.2 试验方法

1.2.1 没食子酸的定量检测[8]

1) 色谱条件。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-0.05%磷酸溶液(5∶95)为流动相，检测波长为272 nm，进样量10 μL。

2) 对照品溶液的制备。取没食子酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每l mL含 30 μg的溶液。

3) 供试品溶液的制备。取药材粉末(过四号筛)约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加10%盐酸溶液10 mL，加热回流3 h，放冷，过滤，滤液置于100 mL量瓶中，用水适量分数次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得，记录对照品和样品的色谱图。

4) 线性关系考察。精密称取没食子酸对照品12.03 mg置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，分别吸取对照品溶液1 mL、2 mL、4 mL、8 mL、12 mL、17 mL于50 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，所得对照品浓度分别为4.82 μg/mL、9.64 μg/mL、19.28 μg/mL、38.56 μg/mL、57.84 μg/mL、81.94 μg/mL，分别取各浓度标准品溶液10 μL进样，记录色谱图峰面积。以峰面积值Y对对照品浓度X进行回归，绘制标准曲线方程。

5) 精密度试验。精密吸取没食子酸对照品溶液(19.28 μg/mL)10 μL，按上述色谱条件，重复进样6次，记录峰面积，计算峰面积的相对标准偏差(RSD)。

6) 稳定性试验。取地榆药材，制备供试品溶液。取供试品溶液，于制备后0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h分别进样，每次进样量10 μL，计算峰面积的RSD。

7) 重现性试验。取地榆药材6份，制备样品供试品溶液，取供试品溶液进样10 μL，计算没食子酸含量。

8) 加样回收试验。取已知含量(3.14 mg/g)的样品0.5 g，共6份，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别加入没食子酸对照品溶液(0.24 mg/mL)5 mL，制备供试品溶液，进行测定，以供试品溶液中绝对质量分数计算加样回收率。

1.3 PBD筛选主要因素

取10 g地榆采用水浴加热进行提取，旋转蒸发仪进行浓缩，滤液浓缩至相对密度为1.35～1.40(70℃)的浸膏。运用Designexpert 10.3.2进行PBD试验，考察各个因素对出膏率和没食子酸提取量的影响。根据中药材中试提取经验，试验对A(浸泡时间)、B(乙醇体积分数)、C(溶剂量)、D(温度)、E(提取时间)、F(提取次数)等6个主要因素进行评价，根据预试验结果确定每个因素高(代码：1)、低(代码：-1)2个水平共12组试验，筛选对出膏率和没食子酸提取量的主要影响因子。PBD试验因素和水平见表1。

1.4 BBD 试验优化提取工艺

取10 g地榆采用水浴加热进行提取，旋转蒸发仪进行浓缩，滤液浓缩至相对密度为1.35～1.40(70℃)的浸膏。根据PBD试验结果，以出膏率(y1)和没食子酸含量(y2)为目标响应值，选取提取次数(x1)、提取时间(x2)和溶剂量(x3)设计3因素3水平的响应面分析试验，响应因素水平见表2。采用多指标数据处理“归一值(OD)”[13]对出膏率和没食子酸含量进行数据处理，OD=(d1d2d3……dn)1/n，n为指数，取值越小越好的指标di=(ymax-yi)/(ymax-ymin)，取值越大越好的指标di=(yi-ymin)/(ymax-ymin)，i=1，2，3……n，n 为指标数。

2 结果与分析

2.1 没食子酸定量检测试验的可靠性

线性关系试验得出标准曲线方程为：y= 255 79x-19 089，R2= 0.999 2，进样浓度在4.82～81.94 μg/mL，表明进样浓度和峰面积线性关系良好。没食子酸对照样品和检测样品的HPLC色谱图见图1。精密度试验得出对照样品RSD<2%，说明仪器精密性良好。稳定性试验表明，没食子酸色谱峰面积RSD值为1.03%，样品供试液在12 h内稳定性良好。重现性试验得出，地榆样品平均含量为1.52 mg/g，RSD<2%，表明该样品处理方法重现性好。加样回收试验表明，没食子酸平均回收率为99.81%，RSD为0.61%，说明方法可靠，准确度好，符合含量测定的要求。

2.2 影响地榆提取工艺的主要因素

按照PBD试验设计，得到各处理的出膏率和没食子酸提取量(表3)。显著性分析结果(表4)表明，溶剂量、提取次数、提取时间对没食子酸提取量的影响达显著水平，浸泡时间、温度、乙醇体积分数的影响不显著；6个试验因子中除提取次数外其余因子对出膏率的影响程度均不显著。因此，溶剂量、提取次数、提取时间是没食子酸提取量和出膏率的主要影响因子，故以溶剂量、提取次数和提取时间进行Box-Behnken试验设计。

表3 PBD试验不同因子与水平下地榆的出膏率和没食子酸提取量

表4 PBD试验各因素对出膏率和没食子酸提取量的影响显著性(P值)

注：* *和*分别表示影响程度达极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)水平。

Note:* *and*indicate significant difference at 1% and 5% levels respectively.

2.3 提取工艺回归模型的建立

根据BBD试验设计，得到溶剂量、提取次数、提取时间不同水平条件的出膏率、没食子酸提取量和OD值(表5)。以OD值为响应值分别对各因素进行多元线性回归和二项式拟合，得到OD值对提取次数x1、提取时间x2和溶剂量x3的二次多项回归方程：OD=-5.21+1.54x1+1.08x2+0.11x3+0.01x1x2+0.02x1x3+0.01x2x3-0.46x12-0.08x22-0.01x32。模型F=24.16，P<0.001，响应回归模型极显著；失拟项P>0.05，失拟不显著，说明该回归模型拟合程度较好[14]。

2.4 地榆没食子酸最佳提取工艺的建立

以x1、x2、x3中任意一个变量固定，其余2个变量对OD值作响应面图。从图2看出，x2和x3对OD值的交互作用不显著，x1和x2对OD值有一定影响，x1和x3对OD值的交互作用明显[15]。根据回归模型，得到地榆的最佳提取工艺为：加33.5倍水，90℃下回流提取2次，每次4.2 h，预测值y1=16.24%，y2=4.25 mg/g。

表5 BBD试验不同处理的出膏率和没食子酸提取量

2.5 最佳提取工艺的验证

取地榆根适量，加33.5倍水， 90℃下回流提取4.2 h，提取2次，按此工艺参数进行3次平行试验，得到平均出膏率为16.27%，没食子酸平均提取量为4.21 mg/g(表6)。没食子酸提取量和出膏率与预测值相近，说明建立的回归模型较好，获得的地榆没食子酸提取最佳工艺具有良好的可信度。

2.6 最佳工艺在生产试验中的应用效果

分别采用原工艺和最佳工艺对5组地榆商品进行扩大化生产试验(20140621、20140526原工艺，20151101、20151102和20151103最佳工艺)，生产试验每组地榆按50 kg进行扩大，配套相应工艺参数，采用多功能提取罐进行提取、真空浓缩回收器浓缩，得到扩大生产后的2种工艺条件下没食子酸转移率和出膏率(表7)。相比于原工艺，最佳工艺的出膏率提高51.0%，没食子酸转移率提高105.8%，均有显著提高。因此，最佳工艺可以应用于实际生产。

表6 地榆没食子酸最佳提取工艺验证试验结果

表7 地榆没食子酸最佳提取工艺在生产试验中的出膏率和没食子酸提取量

3 结论与讨论

通过Plackett-Burnman设计和Box-Behnken-响应面法优化地榆没食子酸的提取工艺，得到地榆没食子酸的最佳提取工艺为加33.5倍水，90℃下回流提取2次，每次4.2 h。与原工艺提取比较，应用该工艺对地榆进行提取，其出膏率提高51.0%，没食子酸转移率提高105.8%，提取效果好。

在中药有效成分提取中需考虑到多个单因素试验以及试验次数较多的正交设计，工作费时费力且具有盲目性，因此，本试验引用全新设计，为提取工艺的研究与提取率的提高提供新的思路和方法。PBD是一种近饱和的两水平筛选试验设计方法，通过比较各因子两水平的差异与整体的差异来确定因子的显著性，能用最少的试验次数快速有效地筛选出显著影响因子[16]。BBD-响应面法具有结果直观、预测性好的优点，试验预测值能更好的考察参数合理性和试验设计的准确性[17]。本研究通过验证试验，其验证结果大于预测值，说明PBD联合BBD-响应面法在中药提取中具有良好的可行性。

PBD试验中发现，高浓度乙醇不利于没食子酸的提取，与蓝海等[12]用醇提没食子酸的最佳工艺相悖，刘丽艳[18]用酸或碱水解得到鞣质，通过乙酸乙酯萃取得到没食子酸的粗提液，但在工业生产中生产成本高昂，不可能采用醇、酸或碱提取。药材在生产试验提取过程中，干膏率和没食子酸提取量均有所下降，所以在提取过程中应尽量将药材分装到较大的袋中，增大药材与水的接触面积，减少药渣与水混合，同时避免粉碎后投料易堵塞过滤网而造成过滤困难。由于工艺采用水提取，试验中得出高温有利于没食子酸提取，但并未对提取温度进行优化，后续试验应该对工艺参数进行更加细化。