杨硕 王斌 夏文水

[摘要] 目的 研究殼寡糖对高脂饮食诱导肥胖小鼠脂肪组织内质网应激及炎性因子释放的影响。 方法 30只C57BL/6J小鼠以随机数字表法分成正常饮食组（Control组）、高脂饮食组（HF组）和高脂饮食+壳寡糖组（HF+COS组），每组10只。喂养16周后进行葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验;收集血清，检测血脂情况;称取小鼠体重、肾周及皮下脂肪组织，比较各组脂肪累积情况;检测脂肪组织中内质网应激标志蛋白葡萄糖调节蛋白（GRP-78）、内质网激酶（PERK）mRNA及蛋白表达，检测脂肪组织核因子-κB（NF-κB）炎症通路变化。 结果 与Control组比较，HF组小鼠血糖、血脂、体重、肾周及皮下组织脂肪细胞体积及重量均明显增加（P < 0.05或P < 0.01），GRP-78、PERK mRNA及蛋白表达增加（P < 0.05），NF-κB通路激活。与HF组比较，HF+COS组上述指标除总胆固醇外均明显降低（P < 0.05）。 结论 壳寡糖可以降低高脂饮食喂养肥胖小鼠血脂，减轻脂肪组织过度积累，缓解内质网应激，并可能通过抑制NF-κB的激活减少炎性因子释放，从而达到缓解胰岛素抵抗的作用。

[关键词] 壳寡糖;脂肪组织;内质网应激;核因子-κB;胰岛素抵抗

[中图分类号] R587          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）03（c）-0009-07

[Abstract] Objective To investigate the effect of chitosan oligosaccharide on the level of endoplasmic reticulum stress and inflammatory factors released in adipose tissue of obese mice induced by high-fat diet. Methods Thirty C57BL/6J mice were divided into normal diet group （Control group）， high-fat diet group （HF group） and high-fat diet+chitosan oligosaccharide group （HF+COS group） according to random number table method， with 10 mice in each group. After being fed for 16 weeks， glucose tolerance test and insulin tolerance test were carried out. Serum was collected to detect lipid profiles， mice body weights， perirenal and subcutaneous adipose tissue weights were estimated within groups. In addition， the protein and mRNA expression of endoplasmic reticulum stress markers glucose regulatory protein （GRP-78） and endoplasmic reticulum kinase （PERK） from adipose tissue were assessed. Meanwhile， the changes of nuclear factor-κB （NF-κB） inflammatory pathways in adipose tissue were also detected. Results Compared with the control group， the levels of glucose， lipid， the body weights and the size and weight of perirenal and subcutaneous adipocytes in HF group were significantly increased （P < 0.05 or P < 0.01）， the mRNA and protein expression of GRP-78 and PERK were increased significantly （P < 0.05）. And the activation states of NF-κB pathway was measured accordingly. Compared with HF group， except for total cholesterol， the mentioned indicators in HF+COS group were significantly decreased （P < 0.05）. Conclusion Chitosan oligosaccharide can lower blood lipids， reduce the excessive accumulation of adipose tissue and relieve endoplasmic reticulum stress in mice fed on high-fat diet. Chitosan oligosaccharide inhibits the activation of NF-κB， resulting in the reduced release of inflammatory factors which is likely to contribute to the insulin resistance alleviation.

[Key words] Chitosan oligosaccharide; Adipose tissue; Endoplasmic reticulum stress; Nuclear factor-κB; Insulin resistance

肥胖是21世纪严峻的健康问题，最新数据表明全球超过4亿人属于肥胖[1]。肥胖患者脂肪组织中存在内质网应激（ERS）[2]。研究表明肥胖患者往往处于慢性炎症状态，当脂肪细胞发生ERS时，炎性因子表达增加，最终可能导致胰岛素抵抗的发生[3]。壳寡糖（chitosan oligosaccharides，COS）是一种天然的水溶性低聚糖，主要提取自海洋生物的甲壳[4]，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化及神经保护等功能[5-7]。本研究主要探讨壳寡糖对高脂饮食诱发肥胖的C57BL/6J小鼠脂肪组织胰岛素抵抗的缓解作用，以期为壳寡糖的生物活性应用提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物  6周龄C57BL/6J小鼠（18～20 g）30只，健康SPF级，雄性，购自上海斯莱克实验动物有限公司[合格证号：SCXK（沪）2007-0005]，12 h明暗光源交替，温度（22±2）℃，相对湿度60%饲养环境。

1.1.2 试剂与仪器  壳寡糖（脱乙酰度90%，分子量1500 Da，浙江金壳药业有限公司）;引物由英俊生物技术有限公司提供;TRIzol试剂（ThermoFisher scientific，10296010）;RNAiso Plus试剂盒（Takara，9108）;SYBR Green（DBI Bioscience，DBI-2043）;抗GAPDH抗体（Santa Cruz，sc166545），兔抗鼠肿瘤坏死因子（TNF）-α（ab6671）、白细胞介素（IL）-6（ab128008）、葡萄糖调节蛋白（GRP）-78（ab21685）、内质网激酶（PERK）（ab79483）、磷酸化-核因子-κB抑制蛋白（p-IκB）（ab32518）、核因子-κB（NF-κB）p65（ab16502）、β-actin（ab8227）和Lamin（ab16048）均购自Abcam。电泳仪（北京六一仪器厂，DYCZ-25D）;低温高速离心机（Eppendorf，5810R）;荧光定量PCR仪（CFX96 TM Real-Time System）。

1.2 方法

1.2.1 肥胖小鼠造模及分组  采用随机数字表法将C57BL/6J小鼠分为正常饮食组（Control组）、高脂饮食组（HF组）和高脂饮食+壳寡糖组（HF+COS组），每组10只。喂养16周，遵守江南大学实验动物伦理委员会规定。HF组给予45%热量高脂饲料（2.9%大豆油、20.7%猪油、46.1%碳水化合物和23.3%蛋白质）[8-9]，HF+COS组高脂饲料中添加5%质量分数壳寡糖[10]，剂量符合毒理安全评价[11]。小鼠体重显著上升被认为成功建模。

1.2.2 葡萄糖耐量试验（GTT）和胰岛素耐量试验（ITT）  小鼠禁食5 h后灌胃给予葡萄糖溶液（2 g/kg），分別于0、30、60、90、120 min时鼠尾采血（5～10 μL）进行GTT试验;ITT试验前小鼠禁食5 h，腹腔注射胰岛素（0.75 U/kg）。分别在注射前（0 min）及注射后30、60、90、120 min鼠尾采血，血糖仪测量血糖水平，计算葡萄糖曲线下面积（AUC）。

1.2.3 小鼠标本留取  每周测量小鼠体重，满16周禁食过夜，次日麻醉脱颈处死，腹主动脉取血，制备血清检测总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和游离脂肪酸（FFA）的浓度。钝性分取肾周及皮下脂肪组织，一部分立即10%甲醛固定，另一部分液氮快速冻存后置于-80℃冰箱中备用。

1.2.4 HE染色形态学观察  每只小鼠的肾周及皮下脂肪组织均于甲醛固定，石蜡包埋切片，常规HE染色，光镜拍照，每个组织随机选取5个视野（200×），测定约200个细胞的大小。

1.2.5 免疫组化分析  脂肪组织制片，抗原修复，3%过氧化氢10 min灭活。山羊血清封闭，分别滴加一抗IL-6（1∶200）和TNF-α（1∶300）4℃孵育过夜。PBS清洗后加二抗，37℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染、脱水、透明、封片，显微镜观察并拍照，每张切片随机选取5个视野，采用Image-Pro图像分析软件进行灰度分析（IOD）。

1.2.6 实时荧光定量  称取80 mg皮下脂肪组织，采用Trizol法提取皮下脂肪组织总RNA，应用逆转录高效试剂盒获取cDNA，操作按试剂盒说明进行。应用荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR扩增，引物信息见表1。以β-actin的表达量作为内参，每个标本设置3个复孔，取复孔平均Ct，通过计算2-ΔΔCt得出各组基因的相对表达水平。

1.2.7 Western blot  分别称取100 mg小鼠皮下脂肪组织，总蛋白及核蛋白的提取操作参照试剂盒说明书。SDS-PAGE凝胶电泳，PVDF膜转膜，采用含5%脱脂奶粉TBST溶液封闭1 h，孵育一抗GRP-78（1∶1000）、PERK（1∶1000）和p-IκB（1∶1000）及核蛋白一抗NF-κB p65（1∶500），4℃过夜，次日洗膜，孵育二抗，37℃ 1 h，采用Supersignal孵育后曝光，通过Image lab软件扫描后对条带进行分析。目的蛋白条带的光密度值与内参GAPDH条带的光密度值相比，NF-κB p65条带光密度值与内参Lamin相比，得到目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行分析，正态分布計量资料采用均数±标准差（x±s）表示，三组数据间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD方法;非正态分布计量资料采用秩和检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 壳寡糖对高脂饮食诱导肥胖小鼠体重、肾周及皮下脂肪组织的影响

与Control组比较，HF组小鼠体重、肾周脂肪和皮下脂肪组织重量均显著升高（P < 0.01），HF+COS组小鼠体重明显升高（P < 0.05）;与HF组比较，HF+COS组小鼠体重、肾周脂肪和皮下脂肪组织重量均显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.2 壳寡糖对高脂饮食诱导肥胖小鼠脂肪细胞的影响

肾周和皮下脂肪组织HE染色提示，与Control组比较，HF组肾周及皮下脂肪组织中脂肪细胞体积均明显增大（P < 0.05或P < 0.01），细胞大小非均一，出现较多冠状结构;与HF组比较，HF+COS组肾周和皮下脂肪组织中脂肪细胞明显变小（P < 0.05），冠状结构减少。

2.3 壳寡糖对高脂饮食诱导肥胖小鼠血脂指标的影响

与Control组比较，HF组小鼠TC、TG、LDL-C以及FFA显著升高，HDL-C显著降低，HF+COS组LDL-C、FFA明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）;与HF组比较，HF+COS组TG、LDL-C、FFA均显著降低，HDL-C显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05）;HF+COS组与HF组TC比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.4 壳寡糖对高脂饮食诱导肥胖小鼠葡萄糖耐受和胰岛素抵抗的影响

GTT试验表明HF组小鼠空腹血糖高于Control组和HF+COS组，且达到峰值后下降速度减慢;HF组血糖AUC显著高于Control组（P < 0.05），但与HF+COS组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。ITT试验结果表明，HF组AUC高于Control组，差异有统计学意义（P < 0.05），胰岛素注射后120 min，HF+COS组小鼠血糖水平较HF组略微上升，AUC下降，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.5 壳寡糖对高脂饮食诱导肥胖小鼠脂肪组织内质网应激相关分子表达的影响

与Control组比较，HF组小鼠的皮下脂肪组织GRP-78和PERK的mRNA及蛋白表达水平均明显升高（P < 0.05或P < 0.01）;HF+COS组小鼠皮下脂肪组织GRP-78和PERK的mRNA及蛋白表达水平较HF组明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.6 壳寡糖对高脂饮食诱导肥胖小鼠脂肪组织炎性因子释放的影响

免疫组织化学法结果显示脂肪组织中IL-6及TNF-α主要分布于细胞质中;免疫组织化学半定量分析结果及RT-PCR结果均显示，与Control组比较，HF组小鼠皮下脂肪组织中IL-6及TNF-α表达明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）;HF+COS组小鼠皮下脂肪组织中IL-6及TNF-α表达明显低于HF组（P < 0.05）。

2.7 壳寡糖对高脂饮食诱导肥胖小鼠脂肪细胞p-IκB、NF-κB p65蛋白表达的影响

Western blot结果显示HF组脂肪组织p-IκB、NF-κB p65蛋白表达明显高于Control组，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）;HF+COS组p-IκB及NF-κB p65表达较HF组降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

本研究通过对高脂饮食诱导的肥胖小鼠喂养壳寡糖，检测肥胖小鼠血糖及血脂代谢水平以及ERS相关分子的变化，初步探讨壳寡糖在缓解ERS、炎性因子释放及胰岛素抵抗中的作用及相关分子机制。结果显示，高脂饮食喂养16周后，HF组小鼠血糖、血脂和体重均明显增加，皮下组织脂肪细胞体积增加并伴炎症细胞浸润;HF+COS组血糖、血清TG、LDL-C和FFA与HF组相比明显降低，体重、肾周及皮下脂肪组织重量均明显降低，脂肪细胞体积减小，这也与以往动物实验结果一致[12-13]。GTT及ITT结果显示壳寡糖未能缓解肥胖诱导的小鼠葡萄糖耐受不良，但对胰岛素敏感性减低却有改善作用，这都提示壳寡糖具有一定程度的降血脂和改善胰岛素抵抗的作用。

壳寡糖具有良好的水溶性，经口服途径摄取后，在小肠上段快速地被上皮细胞吸收[14]，体外Caco-2单层细胞吸收模型验证了壳寡糖轻易地穿越小肠上皮细胞[15]。由此推断壳寡糖在吸收后经血液循环作用于脂肪组织、肝脏和骨骼肌等各个组织，影响葡萄糖和脂质的体内代谢[16]。

肥胖患者不仅血脂代谢紊乱，还长期处于慢性炎性状态[12]。研究发现肥胖患者脂肪细胞可以分泌IL-6、TNF-α等促炎因子，影响全身代谢，导致胰岛素抵抗[17]。ERS可能是连接肥胖、炎症和代谢紊乱的核心机制：肥胖患者往往伴随血脂代谢异常，而血脂代谢异常是ERS重要原因之一，大量研究发现肥胖患者内脏脂肪中ERS相关基因表达显著高于正常体重人群[18];ERS在机体的炎性反应中也发挥着重要作用，参与多种炎症性疾病的发生发展[19]。目前研究发现ERS有3条重要的下游通路：PERK、IRE1和ATF6，这3条通路均可以通过多种途径影响炎性因子的释放，而慢性炎性状态与胰岛素抵抗密不可分[19-20]。因此，寻找改善ERS的干预措施对预防和缓解肥胖患者胰岛素抵抗有重要意义。本研究发现高脂饮食诱导肥胖小鼠皮下脂肪组织内质网应激蛋白GRP-78、PERK表达明显增高，促炎因子IL-6、TNF-α表达增加，而壳寡糖能有效缓解肥胖状态下脂肪组织ERS及炎性因子的释放，因此饮食添加壳寡糖有望成为改善肥胖患者胰岛素抵抗的有效措施。

NF-κB是重要的核轉录因子，参与多种炎症基因的转录调控，在炎性反应中发挥重要作用。目前大量研究证实，ERS的3条下游通路均能激活NF-κB，但机制各有不同[19-20]。在静息状态下，NF-κB与IκB形成复合物，以无活性形式存在于胞质中。当受到多种刺激时，IκB发生磷酸化并与NF-κB分离，无活性的NF-κB蛋白被激活，进而转位至细胞核内，促进炎性因子的分泌和表达，引起胰岛素抵抗。本研究发现，HF+COS组IκB磷酸化水平降低、NF-κB p65入核减少，炎性因子IL-6、TNF-α的生成减少。因此，壳寡糖可能通过缓解脂肪组织ERS，减少下游通路对NF-κB的激活，从而减少炎性因子的释放，达到缓解胰岛素抵抗的目的，但具体机制还有待进一步的研究。

综上所述，壳寡糖能改善高脂饮食诱导的肥胖小鼠高血脂状态，缓解脂肪细胞ERS，抑制炎性因子的释放，并能在一定程度上抑制胰岛素抵抗的发生，对代谢的紊乱具有改善作用，为壳寡糖生物活性研究提供了更全面的认知。

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（收稿日期：2018-03-09  本文編辑：张瑜杰）