25个蝴蝶兰品种气孔特征及其相关性研究和分类学意义

2019-04-27何荆洲黄昌艳闫海霞覃耿敏卜朝阳

西南农业学报 2019年11期

何荆洲，黄昌艳，闫海霞，覃耿敏，卜朝阳

(广西农业科学院花卉研究所，广西南宁 530007)

【研究意义】蝴蝶兰属兰科(Orchidaceae)蝴蝶兰属(Phalaenopsis)常绿草本植物，其花色艳丽、花形奇特、花期长，素有“洋兰皇后”的美称[1]，是世界花卉中最具有价值的盆栽花卉之一[2]。蝴蝶兰市场需求旺盛，促进了其引种、选择和大规模的杂交育种进展，同时也导致蝴蝶兰品种来源复杂，种质形成了丰富的遗传变异。虽然蝴蝶兰各品种之间在形态上有一定差异，但也存在很多共同特征，使得品种间的遗传关系变得模糊不清，因此对蝴蝶兰进行种质资源分类鉴定研究就显得尤为重要。叶是植物重要营养器官，叶表皮结构特征具有一定的遗传稳定性，其微形态特征在一定程度上可以反映植物类群间的亲缘关系，在植物种间、种内或属间分类具有重要的研究意义[3-4]。【前人研究进展】气孔和气孔器是叶片蒸腾与光合作用的通道，是研究植物亲缘关系的重要器官[5-6]，气孔的相关研究在许多作物中已有报道。陈方永等[8]研究表明杨梅叶片气孔的相似度在某种程度上可以作为区别品种的依据。王连珍等[8]曾报道栎属植物叶片的气孔特征具有一定的稳定性，可作为栎属植物组间分类及亲缘关系分析的依据之一。曾妮等[9]对中国蔷薇属植物叶表皮的微形态特征进行了观察，发现叶表皮的微形态特征在属内各组间无明确的规律性，但可为探讨该属种间的分类学及亲缘关系提供依据。【本研究切入点】近年来，采用分子标记技术在蝴蝶兰品种间亲缘演化关系上的研究开展较多，揭示了栽培蝴蝶兰品种之间的遗传关系，为蝴蝶兰种质资源的利用和品种改良奠定了基础[10-11]，但国内外有关蝴蝶兰属叶片气孔的研究报道甚少。【拟解决的关键问题】为了明确蝴蝶兰品种间的分类关系，对25份蝴蝶兰栽培品种叶片的气孔进行了显微观察比较、相关性分析及聚类分析，以期通过蝴蝶兰属植物气孔和气孔器特征的比较，为进一步研究蝴蝶兰进化、分类及遗传育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

25个供试品种均来自于广西农业科学院花卉研究所观赏植物研发中心的育苗温室。选取处于2.5寸杯生长期的植株采集叶片，采集时间为上午9:00-11:00。25个品种在花型上涵括了蝴蝶兰小花型品种(花长<4.5 cm)、中花型品种(4.5 cm<花长<8 cm)及大花型品种)(花长>8 cm)，同时在花色上也包含了红色花、黄色花、白色花、线纹花及斑点花(表1)，说明供试材料具有广泛的代表性。

表1 25个蝴蝶兰品种特征

续表1 Continued table 1

编号Number品种Variety品种特征Variety characteristics17R41中型花,黄色紫红线纹斑点花,中萼片紫红色紫红斑点18R42大型花,白色紫红边,中萼片白色紫红边193R12大花型,紫红色花,中萼片紫红色203R14中花型,紫红色花,中萼片紫红色213R63小花型,紫红色花,中萼片紫红色22S大花型,紫红色花,中萼片紫红色23G中花型,紫红色花,中萼片紫红色24H大花型,紫红色花,中萼片紫红色25L大花型,黑红色花,中萼片黑红色

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理将采集到的蝴蝶兰叶片用蒸馏水清洗干净，晾干，用FAA固定液(50 %乙醇∶冰醋酸∶甲醇=18∶1∶1)固定，放置4 ℃冰箱保存。

1.2.2 临时玻片的制作将固定24 h以上的蝴蝶兰叶片取出，剪取叶片中部约1 cm×1 cm大小片段(绕开叶片主脉)，浸泡到2 % NaOCl溶液中，80 ℃恒温水浴30 min，直至叶片材料变白；取出，水洗2遍；用镊子分别撕取上下叶表皮，去掉叶肉组织，放在载玻片上并盖上盖玻片，制成临时玻片。

1.2.3 气孔观察在 OLYMPUS 光学显微镜10×10下观察记录3个视野(显微镜视野半径为 2 mm，视野面积为12.566 mm2)下的蝴蝶兰叶片上表皮细胞数(x1)、上表皮气孔数(x2)、下表皮细胞数(x3)和下表皮气孔数(x4)，计算气孔密度(x5)和气孔指数(x6)；显微镜10×40下采用测微尺测量5个气孔的外纵径(x7,2个保卫细胞外壁长轴两端间的距离)、外横径(x8,2个保卫细胞外壁短轴两端间的距离)、内纵径(x9,2个保卫细胞内壁长轴两端间的距离)和内横径(x10,2个保卫细胞内壁短轴两端间的距离)，计算气孔开度(x11)、气孔面积(x12)和气孔比(x13)。

1.3 统计分析

测试数据经Excel 2003统计分析软件进行整理统计，并利用SPSS 19.0对统计数据进行遗传相关分析和主成分分析[12-13]，采用欧式距离法进行聚类分析并绘制聚类图，各气孔参数指标按下式计算[14]。

气孔密度(个/mm2)=气孔数/视野面积

气孔指数(%)=气孔数/(气孔数+细胞数) ×100

气孔开度=内横径×内纵径

气孔面积(mm2)=1/4×3.14×(外横径×外纵径)

气孔比=外纵径/外横径

2 结果与分析

2.1 25个蝴蝶兰品种叶片气孔器的分布及特征

25个蝴蝶兰品种叶片上下表皮均有气孔分布，

A：上表皮气孔分布； B：下表皮气孔分布A: Upper epithelium porosity distribution; B: Lower epithelium porosity distribution图1 蝴蝶兰叶片气孔分布Fig.1 Porosity distribution in Phalaenopsis leaves

A：扁圆形气孔器；B：圆形气孔器A: Oblate porosity; B: Circular porosity图2 蝴蝶兰叶片气孔器形状Fig.2 Shape of porosity in Phalaenopsis leaves

但气孔数量不同，普遍以上表皮分布量较多，气孔排列属无规则型；而上下表皮的细胞形状为多边无规则形，细胞间相互嵌和，排列紧密、无细胞间隙(图1)。各品种蝴蝶兰气孔器形状差别不大，均呈圆形或扁圆形，2个保卫细胞对称排列，呈肾形；在保卫细胞的外围有1对保卫细胞与其长轴平行，属于平行型气孔(图2)。

2.2 25个蝴蝶兰品种叶子气孔密度和气孔指数比较

由25个蝴蝶兰品种的叶片上表皮细胞数、上表皮气孔数、下表皮细胞数、下表皮气孔数、气孔密度和气孔指数的观测结果(表2)可以看出，25个供试品种经方差分析在叶片上表皮细胞数、上表皮气孔数、下表皮细胞数、下表皮气孔数、气孔密度和气孔指数中均存在差异显著性。蝴蝶兰叶片上、下表皮细胞数均集中在80～230个/12.566 mm2，其中R1、A和R43的上表皮细胞数均超过200个/12.566 mm2，以R1最多，为224个/12.566 mm2；下表皮细胞数均超过200个/12.566 mm2的品种有R1、13和A，分别为215.67、223.67和228.33个/12.566 mm2，但三者差异不显著。蝴蝶兰叶片上下表皮气孔分布数量不同，供试的25个蝴蝶兰栽培品种有20个品种上表皮气孔数多于下表皮气孔数，占比80 %；上表皮气孔数集中在2～15.5个/12.566 mm2，其中>4个/12.566 mm2有20个品种，占供试品种的80 %，以A最多，为15.3个/12.566 mm2；下表皮气孔数集中在0～13个/12.566 mm2，其中>4个/12.566 mm2只有8个品种，占供试品种的32 %，以R43最多，为12.67个/12.566 mm2，而R7的下表皮细胞中所观测的5个视野中均未找到气孔器。供试品种的气孔密度跨度较大，为37.14～169.77个/mm2，其中A品种气孔密度最大，为169.77个/mm2，这与A上表皮气孔数最多相一致；而气孔指数跨度较小，主要集中于2.08 %～5.66 %。

表2 25个蝴蝶兰品种气孔密度和气孔指数的比较

续表2 Continued table 2

品种Varieties上表皮细胞数(个)Cell number of upper epidermis上表皮气孔数(个)Stomatal number of upper epidermis下表皮细胞数(个)Cell number of lower epidermis下表皮气孔数(个)Stomatal number of lower epidermis气孔密度(个/mm2)Stomatal density气孔指数(%)Stomatal indexK170.75±4.11c4.00±0.82hijk134.25±0.96d8.00±0.00b95.50±6.50cd3.79±0.24cdefghJ104.75±5.50gh5.50±1.29fghij107.25±6.60hi2.50±0.58fghi63.66±6.50efgh3.64±0.44cdefghi3R19122.67±4.04ef6.00±0.00efgh123.00±3.61ef6.33±0.58c98.15±4.59c4.79±035abcW5102.00±6.06gh2.00±0.82k81.75±3.59j4.50±0.58de51.73±7.96ghi3.40±0.32efghijkR30130.00±1.73e3.67±1.53ijk132.67±2.89de2.33±0.58fghij47.75±15.92hi2.23±0.73lmR43200.00±7.94b7.00±1.00edef176.0±16.09c12.67±2.08a156.51±20.03a5.00±0.87ab3R17100.00±1.73ghi4.00±0.00hijk110.67±5.13ghi6.00±1.00cd79.58±7.96cdef4.52±0.30bcdeR41102.33±10.02gh5.33±1.16fghij118.00±6.25fgh3.00±0.00efg66.32±9.19cdefghi3.65±0.56cdefghiR4298.33±21.13ghi6.33±1.53defg117.00±3.46fghi3.67±1.53ef79.58±23.87bcdef4.45±1.30bcdef3R12122.00±3.61ef6.33±1.53defg116.33±2.52fghi2.33±0.58fghij68.97±16.57defghij3.50±0.77defghij3R14102.67±6.35gh5.00±1.0fghij106.33±7.37i3.00±2.00efg63.66±13.78cdefghi3.71±0.97cdefghi3R63128.67±7.02e9.67±1.16b122.33±14.65ef5.33±0.58cd119.37±7.96b5.66±0.58aS81.50±4.44j3.75±1.50ijk87.00±2.94j2.75±0.50fgh51.73±13.78ghi3.70±0.90cdefghiG111.00±2.58fg4.00±1.63hijk114.50±7.59fghi0.75±0.50jk37.80±10.01i2.08±0.60mH93.50±6.66hij5.75±0.96fghi105.50±5.75i3.00±0.00efg69.63±7.62efgh4.21±0.50bcdefL153.00±8.52d3.5±1.29jk115.00±5.10fghi5.75±1.26cd73.61±19.89defg3.32±0.8fghijkl

注：同列数据后不同小写字母表示在5 %水平差异显著，下同。

Note： Different lowercase letters of longitudinal are represented by significant differences at 5 % level. The same as below.

2.3 25个蝴蝶兰品种气孔器特征比较

由25个蝴蝶兰栽培品种气孔器的外纵径、外横径、内纵径、内横径、气孔开度、气孔面积和气孔比的观测结果(表3)可以看出，25个供试栽培品种经方差分析在气孔器的外纵径、外横径、内纵径、内横径、气孔开度、气孔面积和气孔比中均存在差异显著性，其中R7气孔器的外纵径、内纵径和内横径最小，分别为18.48、8.3和9.99 mm，因此它的气孔开度、气孔面积和气孔比也是最小的，分别为84.6、375.92 mm2、0.72；而R5拥有最大的气孔器内纵径和内横径，为：28.12和26.99 mm，气孔开度达到758.55 mm2，为供试品种中最大者；R42的气孔器外横径最大，为45.95 mm，气孔面积达到1430.30 mm2；而气孔比最大的3个品种为3R12、3R63和G，它们的气孔比分别为1.32、1.34和1.35，这3个品种的气孔比差异不显著；25个供试品种的气孔比为0.72～1.35，说明蝴蝶兰各品种气孔器形状差别不大，呈圆形或扁圆形，与直观观测形状相一致。综上可知，不同蝴蝶兰品种在气孔特性方面呈现出了不同的特点。

表3 25个蝴蝶兰品种气孔器特征的比较

续表3 Continued table 3

品种Varieties内纵径(mm)Inner longitudinal diameter内横径(mm)Inner transverse diameter外纵径(mm)External longitudinal diameter外横径(mm)External transverse diameter 气孔开度(mm2)Stomatal aperture 气孔面积(mm2)Stomatal area气孔比Stomatal ratioR78.39±0.60g9.99±1.93k18.48±1.19j25.93±2.06ghi84.60±22.57i375.92±36.14j0.72±0.08i1311.06±0.87fg11.76±2.10hijk25.43±3.50i24.93±5.87hi131.67±29.66ghi507.65±145.73ij1.06±0.20badefA11.94±2.61fg14.73±3.39defghijk34.37±2.63efgh27.89±2.51efghi182.40±75.15fghi749.65±50.30ghi1.25±0.19abK20.96±6.37bcd21.02±7.19bc38.65±8.42cdefg34.74±8.94cd467.13±255.09bcd1092.70±434.28bcdef1.15±0.24abcdeJ14.12±0.90efg13.40±3.37fghijk30.49±5.04h24.03±4.94i191.44±57.51fghi589.44±205.18ij1.28±0.16ab3R1916.48±3.81cdef17.29±4.75bcdefgh39.89±2.69bcde32.27±2.13def298.34±144.40defgh1014.26±136.80cdefg1.24±0.01abcW515.87±1.91def10.38±0.55k34.61±1.3efgh43.15±5.87ab165.11±25.27fghi1172.36±163.73abcde0.81±0.11hiR3020.24±2.53bcde12.78±2.79ghijkd37.20±1.46defg42.46±1.97ab259.44±70.40efghi1238.29±24.52abc0.88±0.07fghiR4318.85±2.57bcde16.54±1.51bcdefghi33.77±3.12fgh47.25±6.40a309.46±26.46cdefgh1248.17±161.07abc0.73±0.12i3R1716.57±5.65cdef17.61±3.29bcdefg44.86±4.17ab34.79±3.50cd306.61±174.61cdefgh1229.39±213.07abcd1.30±0.14abR4115.46±3.47def14.40±2.05efghijk30.88±6.16h35.71±4.17cd218.56±37.05efghi881.55±277.16fgh0.86±0.08ghiR4220.36±3.40bcde14.80±3.34defghijk39.30±3.13cdef45.95±7.51a293.27±28.03defgh1430.30±315.22a0.87±0.11fghi3R1222.36±3.15bc21.86±4.06b43.92±6.11fabc33.65±5.79abcdecdef495.82±149.48bc1171.67±292.47abcde1.32±0.19a3R1422.99±7.77ab20.32±5.78bcd41.53±1.46bcd39.26±1.17bc503.20±264.18b1279.83±55.63ab1.06±0.05bcdef3R6319.02±4.99bcde20.03±5.81bcde46.94±1.16a35.29±3.14cd393.05±171.89bcde1301.99±140.82ab1.34±0.10aS10.45±1.83fg14.19±3.67fghijk31.16±1.38h30.25±2.90defgh144.29±19.29ghi740.93±91.49hi1.04±0.09cdefgefgG12.09±5.02fg15.10±4.07defghijk39.84±2.64bcde29.78±2.61 defghi195.69±129.57efghi930.12±88.97efgh1.35±0.16aH11.03±3.81fg15.54±3.49cdefghijk37.23±1.43defg30.93±2.56 defgh180.03±85.69fghi903.17±69.46fgh1.21±0.13abcdL14.35±3.81efg15.72±3.13cdefghij35.49±3.35efgh30.39±2.25defgh234.69±109.17efghi845.25±89.23fgh1.17±0.16abcd

2.4 25个蝴蝶品种兰叶片气孔指标的相关性分析

表4表明，蝴蝶兰叶片13个气孔指标间具有较高的相关性，如：气孔开度与内横径的相关性指数高达0.940，与内纵径相关性指数为0.925，上表皮细胞数和下表皮细胞数的相关性指数也达到0.905，均呈极显著正相关(P<0.01)。上表皮细胞数与下表皮细胞数、上表皮气孔数和气孔密度呈极显著正相关，相关系数分别为：0.905、0.629和0.666；气孔密度与上表皮细胞数、上表皮气孔数、下表皮细胞数、下表皮气孔数和气孔指数呈极显著正相关，相关系数为：0.666、0.745、0.634、0.753和0.659；气孔指数与下表皮气孔数和气孔密度呈极显著正相关，相关系数分别为0.687和0.659；气孔外纵径与外横径、内纵径、内横径、气孔开度、气孔面积和气孔比均呈极显著正相关，相关系数分别为0.398、0.541、0.630、0.555、0.808和0.557；气孔开度与外纵径、内纵径、内横径和气孔面积呈极显著正相关，相关系数分别为0.555、0.925、0.940和0.407；气孔面积与外纵径、外横径和内纵径呈极显著正相关，与内横径和气孔开度呈显著正相关(P<0.05)，相关系数分别为0.808、0.855、0.622、0.407和0.475；气孔比与外纵径呈极显著正相关，与内横径呈显著正相关，相关系数分别为0.557和0.496。

表4 25个蝴蝶兰品种13个叶片气孔指标的相关系数

注：*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。

Note： *,** indicate significant difference at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

2.5 25个蝴蝶兰品种叶片气孔特性的主导因子分析

通过主成分分析，将25个蝴蝶兰品种的13个与气孔特征相关的指标(x1～x13)依次转化为13个主成分，前4个主成分贡献率分别为33.476 %、27.226 %、18.369 %和11.990 %，它们的累积贡献率达到91.062 %，大于85 %(表5)，在主成分分析中，选择前4个主成分作为蝴蝶兰资源气孔特征的重要主成分。

由表5～6可知，蝴蝶兰品种气孔特征指标的第一个主成分特征值为4.352，贡献率为33.476 %，对应较大的载荷有外纵径、内纵径、内横径、气孔开度和气孔面积，反应了植物气孔的面积和开张状况，因而第一主成分可作为反应蝴蝶兰叶片气孔面积和开张的综合因子；第二主成分特征值为3.539，贡献率为27.226 %，对应较大的载荷有上表皮细胞数、上表皮气孔数、下表皮细胞数和气孔密度，反应了蝴蝶兰叶片气孔密度状况，因而第二主成分可作为反应蝴蝶兰叶片细胞和气孔的数量综合因子；第三个主成分特征值为2.388，贡献率为18.369 %，对应较大的载荷为下表皮气孔数和气孔指数，反应了蝴蝶兰叶片气孔指数状况；第四个主成分特征值为1.559，贡献率为11.990 %，对应较大的载荷为气孔比，反应了蝴蝶兰叶片气孔器的形状状况。

表5 25个蝴蝶兰品种气孔指标的特征值和贡献率

表6 13个气孔指标载荷矩阵

2.6 25个蝴蝶兰品种聚类分析结果

根据各品种叶片气孔和气孔器的特征指标测定结果，采用欧式距离法对供试的25个蝴蝶兰栽培品种进行聚类分析(图3)，结果显示，在欧式距离15处，供试的25个蝴蝶兰品种可被分成3类：第一类是大花型品种(花长>8 cm)且花瓣有紫红色线纹的蝴蝶兰品种2个；第二类为小花型品种(花长<4.5 cm)且花瓣有紫红色线纹的蝴蝶兰品种1个；第三类为花瓣没有线纹或线纹颜色非紫红色的蝴蝶兰品种22个，这种聚类结果与蝴蝶兰花瓣的形态特征密切相关。可见，基于叶片气孔和气孔器特征指标的聚类分析能够反映出蝴蝶兰品种的亲缘关系，可以用于蝴蝶兰的分类鉴定。

3 讨论

植物气孔是在长期的进化过程中，经过适应不同环境而留下来的重要生理器官，形态稳定性较高，此外气孔形态对植物光合作用和蒸腾作用有着重要的作用[15]。不同植物气孔的大小、数目和分布不同。大部分植物叶片的上、下表皮都有气孔，但不同类型的植物其叶上、下表皮气孔数量不同[16]。本研究中，在所观测的5个视野内除R7的下表皮细胞中未找到气孔器之外，其余蝴蝶兰品种叶片上下表皮均有气孔分布，其中有20个品种上表皮气孔数多于下表皮气孔数，占供试品种的80 %；25个供试品种的气孔比为0.72～1.35，说明蝴蝶兰各品种气孔器形状差别不大，呈圆形或扁圆形，与直观观测形状相一致。气孔密度作为反应叶片气孔数量的一个重要指标，历来受到研究者的重视，赵秋玲等[17]认为气孔密度的差异在同属植物的种间相对较小，在异属植物的种间较大；而王连珍等[8]比较了13种栎属植物的气孔密度，结果表明栎属植物的气孔密度变异较大；本研究中，蝴蝶兰供试品种的气孔密度跨度较大，分布于在37.14～169.77 mm2，其中A品种气孔密度最大，R2气孔密度最小，说明了蝴蝶兰属植物的气孔密度变异较大，这与后者的研究结果相似。

图3 基于叶片气孔和气孔器形态参数的聚类分析结果Fig.3 Cluster analysis of leaf stomatal and stomatal morpholoqical parameters

本研究中，蝴蝶兰叶片的气孔面积与气孔开度呈显著性正相关，这说明植物进行光合、呼吸和蒸腾作用等生理活动时，叶片上需要一定数量的气孔面积；气孔开度在一定程度上决定了气孔面积。同时，蝴蝶兰叶片一些气孔指标间具有较高的相关性，如气孔开度与内横径的相关性指数高达0.940，与内纵径相关性指数为0.925，上表皮细胞数和下表皮细胞数的相关性指数也达到0.905。选育过程中通过对相关系数较高的性状进行选择时，可能会影响到另一个性状，因此，在对多个叶片性状进行改良时，应该关注这些性状彼此间的相关性并充分利用这些相关性来提高育种效率。

通过对13个气孔特征指标进行主成分分析，得到这些性状的特征值、贡献率、累计贡献率和因子载荷量，并将13个气孔特征指标综合为4个主成分，前4个主成分累计贡献率达91.062 %，主要反映了气孔面积、气孔密度、气孔指数和气孔形状等，它们是造成蝴蝶兰品种叶片气孔表型差异的主要因素。利用欧氏距离法对25个蝴蝶兰品种进行了聚类，当欧式距离为10时，发现花瓣不含线纹或线纹非紫红色的可以归为一类，而在花瓣含紫红色线纹的品种中又可以区分出大花型和小花型两类，这于蝴蝶兰品种的直观表现基本相符。可见，基于气孔特征指数的聚类分析能反映出蝴蝶兰品种间的亲缘关系，蝴蝶兰的气孔特征指数可以作为蝴蝶兰品种分类的依据之一。

气孔作为植物的初生保护结构，具有一定的稳定性，但同时气孔特征在很大程度上会受到环境和栽培管理的影响，因此本研究为求检测的一致性，选择了在同一环境条件下的自有资源圃里采集样品，样品的生长期均处于2.5寸杯生长期。用气孔性状来区别蝴蝶兰品种，仅是综合鉴定的一个措施之一，它既有一定的可靠性，同时也存在一定的误差。因此，气孔观察只是形态鉴定的一个手段，对于蝴蝶兰品种的鉴定还需借助细胞生物学和分子生物学、形态学和基因组学等手段一起综合检测研究。