徐 微张 鑫潘 磊陈培丰#

1 浙江中医药大学第一临床医学院 浙江 杭州 310053

2 河南省新密市中医院 河南 新密 452370

3 浙江中医药大学附属第一医院 浙江 杭州 310006

蛇六谷，又名魔芋，性味辛寒，有小毒，具有化痰散结、行瘀消肿止痛等功效，作为抗癌中药在浙沪地区广泛使用。现代研究发现蛇六谷中魔芋葡甘露聚糖(KGM)含量最多，约占50%～60%，是蛇六谷抗肿瘤作用的主要成分[1]。本实验在建立Lewis肺癌小鼠动物模型的基础上，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测KGM对荷瘤小鼠脾细胞核转录因子-κB（NF-κB）、核因子-κB抑制因子（IκB）表达的影响，为KGM的抗肿瘤作用提供一定的分子学依据。

1 实验材料

1.1 实验动物:SPF级近交C57BL/6纯系小鼠50只，雄性，6～8周龄，体重16～20g；Lewis荷瘤小鼠4只，均购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司。动物合格证号:SCXK:（沪）2013-0016，饲养于我校动物实验中心SPF级动物房。

1.2 实验药物:纯化魔芋微粉，成都市圣特蒙魔芋微粉有限责任公司，批号:140305，KGM含量为98%。环磷酰胺（CTX），0.2g/瓶，山西普德药业股份有限公司生产，批号:04141103。

1.3 试剂及仪器:RPMI-1640、DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶，美国Gibco公司；红细胞裂解液，Beyotime公司；PBS（磷酸盐缓冲液），吉诺生物医药技术有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，上海翊圣生物科技有限公司；小鼠NF-κB ELISA和IκB ELISA试剂盒，上海翔升生物科技有限公司。

2 实验方法

2.1 造模及分组方法:在无菌条件下，颈椎脱臼法处死4只荷Lewis肺癌小鼠，取生长良好的新鲜肿瘤组织，剔除包膜及坏死组织，剪碎，匀浆，过滤制成混悬液，离心后加生理盐水，将细胞浓度调整至1×107/ml。在无菌条件下以0.2ml/只（含瘤细胞数2×106个）接种于50只C57BL/6小鼠右侧腋窝皮下，30min内完成。接种24h后，将50只小鼠采用随机数字表法分为5组，分别为荷瘤空白对照组（NS组），阳性对照组（环磷酰胺组，CTX组），KGM低、中、高剂量组，每组10只并称重。

2.2 给药方法:参考林慧敏等[2]的给药方法，将KGM溶于水，其中KGM低、中、高剂量组分别按100mg/(kg·d)、200mg/(kg·d)、300mg/(kg·d)连续灌胃13d，每日总量0.2ml；生理盐水组以等剂量灌胃生理盐水13d；环磷酰胺组给药剂量参照人鼠给药剂量换算，以30mg/kg腹腔注射给药，2次/周，共计4次。

2.3 脾脏标本采集:给药后第14d颈椎脱臼处死小鼠，置于75%的酒精中浸泡5min，在超净工作台上，用无菌剪刀快速剪开小鼠皮肤，以新的无菌剪刀剪开腹膜，取出脾脏，放入液氮中冷冻备用。

2.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测脾脏细胞中NF-κB和IκB-α的表达:分述如下。

2.4.1 蛋白提取:采用液氮充分研磨脾组织，加入200μl蛋白提取缓冲液（50mM Tris HCl pH 7.6，1mM CaCl2，0.2%Triton X-100，0.5mM PMSF），充分振荡混匀，室温裂解10min。离心机转速调整至12000rpm，离心10min，离心结束后将上清液转至新的离心管中，放于-80℃冰箱备用。

2.4.2 蛋白浓度测定分析:①配置统一的蛋白质标准品（规格见表1）:以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的标准品溶液（浓度为2mg/ml）制作蛋白质浓度标准曲线。分别吸取BSA标准品溶液0μl、25μl、50μl、125μl、150μl、350μl、375μl、395μl 和400μl，各自加入0.01MPBS溶液补足到2000μl，配成梯度浓度的标准品溶液，分装后-20℃保存，备用。②配制BCA工作液:计算所需要的总BCA工作液体积。总BCA工作液体积=（BSA标准品+待测样品）×重复数×每个样品所需要的BCA工作液；将BCA试剂A和B按照50∶1的体积比混合均匀，注意二者混合后迅速浑浊，混匀后混合物迅速变澄清。将上述步骤所得混合工作液装入密封容器内，室温条件24h稳定。

表1 配置BSA标准品体系

2.4.3 微孔板检测方法（样品:BCA工作液=1∶8）:各取10标准品和待测样品加入到微孔板中（即1∶20），试剂盒的检测范围为125～2000μg/ml。注意:待测样品要先稀释一定的倍数再进行测量，稀释的倍数需进行摸索。在每孔中加入200μl BCA工作液，振荡30s混合均匀。盖上微孔板，37℃条件下孵育30min。室温冷却，在酶标仪上的562nm波长范围处检测吸光度。绘制标准曲线，计算蛋白浓度。

2.5 统计学方法:采用SPSS17.0软件对实验所得数据进行统计学分析，最终结果以±s的形式表示，样本符合正态分布且方差齐性时，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示具有统计学意义差异。

3 结果

3.1 成功建立小鼠移植瘤模型:接种7d后可在各小鼠腋窝皮下触及米粒大小的结节，质硬，活动度一般，边界清楚，表面凹凸不平，连续观察13d，期间小鼠腋下结节增大明显，表示移植瘤接种成功，符合实验要求。

3.2 KGM对荷瘤小鼠脾细胞NF-κB、IκB表达的影响：见表2。

表2 KGM对荷瘤小鼠脾脏细胞NF-κB、IκB表达的影响（±s，pg/ml）

表2 KGM对荷瘤小鼠脾脏细胞NF-κB、IκB表达的影响（±s，pg/ml）

注:与NS组比较，☆P＜0.05，△P＜0.01；与CTX组比较，▲P＜0.01。

IκB表达量39.28±5.95▲64.04±6.55△45.78±2.98▲49.01±3.91☆▲66.96±5.69△组别NS组CTX组KGM低剂量组KGM中剂量组KGM高剂量组例数10 10 10 10 10 NF-κB表达量360.83±16.71▲245.35±24.35△334.79±15.59▲316.13±29.83☆▲246.41±10.76△

4 讨论

我们前期研究发现KGM可有效抑制荷瘤小鼠瘤体的生长，提高荷瘤小鼠的胸腺和脾脏指数，而且荷瘤小鼠脾细胞中T细胞增殖分化也有显著提高；还可能通过影响THP-1源巨噬细胞白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和γ干扰素（IFN-γ）mRNA及蛋白的表达来达到免疫调节的作用，从而发挥抗肿瘤作用。故提高荷瘤小鼠的免疫功能可能是KGM抗肿瘤的机制之一。关于KGM的抗肿瘤机制应该还有很多，本实验则尝试从抑制肿瘤血管生成方面探讨KGM的可能作用机制。

抑制肿瘤血管生成是防止肿瘤侵袭及转移、改善患者预后和提高生存率的重要措施之一。目前研究已发现30余种促血管生成因子，其中血管内皮细胞生长因子（VEGF）是重要的因子之一。NF-κB是一类普遍存在的转录调节因子，有抑制凋亡、促进肿瘤细胞增殖、血管生成和转移等作用。VEGF的表达与NF-κB成正相关，在肿瘤的血管形成中NF-κB起着核心作用，可通过上调核心因子VEGF的表达来促进肿瘤血管形成。而NF-κB的激活受其抑制因子——IκB(尤其是IκB-α)的调控。IκB可通过与NF-κB二聚体结合，形成NF-κB/IκB复合物。外源性刺激通过活化IκB激酶（IKK）使得IκB磷酸化，并进一步降解，使NF-κB发生核异位，与靶基因的特异位点相结合，从而使NF-κB失去活性，抑制肿瘤生长及减少新生血管生成。所以NF-κB、IκB二者在肿瘤的形成及发展过程中具有举足轻重的作用。

本实验通过检测荷瘤小鼠脾细胞NF-κB及IκB的表达发现，荷瘤空白对照组中NF-κB表达量最高，而IκB表达量最低，随着KGM用药浓度的增加，NF-κB的表达量逐渐降低，IκB的表达则逐渐上升，虽然三个KGM给药组之间并无显著性差异（P＞0.05），但仍具有一定的量效关系。故我们认为，KGM的抗肿瘤作用也可能是通过下调NF-κB并且上调IκB的表达，或者稳定IκB的活性、抑制了VEGF的表达，从而抑制了肿瘤新生血管的生成，进而抑制了肿瘤的增殖及转移来实现的。所以，KGM的抗肿瘤机制仍需要进一步的深入探讨。