鞠蔚华，李 钦，韩 铭，刘顺爱，吴 君，成 军△，梁跃东

(1.贵州医科大学附属医院感染科，贵阳 550004；2.首都医科大学附属北京地坛医院传染病研究所，北京 100015)

原发性肝细胞癌(HCC)是全球常见的恶性肿瘤之一，尤其以亚洲和非洲国家高发，也是病死率最高的癌症之一[1-2]。我国是全球HCC患者最多的地区，HCC位居常见恶性肿瘤第3位，HCC也在全球癌症死亡的原因中排名第2位[3]。肿瘤对放化疗抵抗及手术切除后复发与转移是引起HCC快速发展和早期侵袭的主要原因[4]，临床调查研究表明，原发性肝癌根治性切除术后病死率可下降至5%以下，但患者术后5年内手术部位转移及复发率高达60%～70%[5]。因此，寻求HCC发生、发展的其他的分子生物学机制，明确诱发HCC的生物指标并提供有效的诊疗靶点是当前的迫切任务[6]。研究发现，乙型肝炎病毒(HBV)前S1蛋白(HBV pre-S1)具有广泛的反式激活功能，通过反式激活，它调节肝细胞中相关基因的表达并影响肝细胞分化、增殖、凋亡等生物学功能，在参与HBV致病机制和诱发肝癌中具有重要作用，但HBV感染导致HCC发展的分子机制尚未完全清楚[7]。2004年，本课题组运用抑制性消减杂交技术筛选和克隆出HBV P-S1蛋白反式激活靶基因2(PS1TP2)。最近的研究表明，PS1TP2在肿瘤组织如人结肠癌中高表达，但在结肠组织细胞中表达量低甚至不表达，并与肿瘤分化、分级和分期，细胞增殖、迁移和凋亡，放化疗等相关[8]。目前鲜见PS1TP2在肝癌中相关作用机制研究的报道。因此，本研究探究PS1TP2对肝癌细胞HepG2增殖与凋亡的影响，以确定PS1TP2是否通过细胞增殖、凋亡影响HBV相关肝病的发病机制和进展。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞和siRNA L02细胞、HepG2细胞取自北京地坛医院传染病研究所实验室；PS1TP2 siRNA与目的序列无同源性的通用阴性对照siNC由上海吉玛制药技术有限公司合成。siRNA序列见表1。以上化学合成PS1TP2基因的小片段干扰RNA(siPS1TP2)转染HepG2细胞，筛选沉默效果最佳干扰序列，用于后续实验。

1.1.2试剂 细胞DMEM培养基和胎牛血清 (美国Life Techology公司)；总RNA提取试剂盒(美国Omega公司)；jet PRIMETM转染试剂(法国Polyplus Transfection公司)；荧光定量PCR(RT-PCR)试剂Power SYBR GREEN PCR Master Mix(美国Applied Biosystem公司)；细胞凋亡检测试剂 AnnexinV-FITC和 7-AAD(美国Biolegend公司)；兔抗人腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、雷帕霉素靶蛋白(m-TOR)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)及Bcl-2相关X蛋白(Bax)、兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)多克隆抗体、山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)-辣根过氧化物酶(HRP)和山羊抗鼠IgG-HRP(美国Santa cruz公司)。

1.2方法

1.2.1RT-PCR检测PS1TP2基因在L02、HepG2中的表达 将L02细胞和HepG2细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，放于5%CO2、37 ℃孵箱中培养；细胞汇合度为培养瓶底的80%～90%时，即可收集细胞，根据Total RNA Kit试剂盒步骤提取总RNA，将提取的RNA反转录为cDNA,然后依据Power SYBR®Green PCR Master Mix 说明书检测PS1TP2基因在两种细胞中的表达量。

1.2.2PS1TP2 siRNA转染与分组处理 在HepG2细胞铺展开在培养瓶底部汇合度为80%～90%时即可分板处理，待6孔板细胞达到60%～70% 汇合度，可分别转染小干扰RNA(siRNA)作为干扰组、siNC作为对照组进行后续实验。

1.2.3CCK-8活性检测试剂盒测定细胞增殖水平 接种对数生长期HepG2细胞于3个96孔板(2×103/孔)，各设置6个重复孔。同时转染后分别于不同时间点(24、48、72 h)加入CCK-8试剂，每孔加10 μL，继续培养1 h。上机测定每个孔的450 nm波长的光密度(OD)值，重复3次。

1.2.4Annexin V检测细胞凋亡程度 转染培养HepG2细胞48 h后，收集细胞，按照 Annexin V /7-AAD 检测试剂说明书加入Annexin V与7-AAD染料处理细胞，使用流式细胞仪上机检测细胞凋亡。

1.2.5RT-PCR检测目的基因表达水平 转染后培养HepG2细胞48 h，按照上述实验方法提取HepG2细胞中总RNA，并把提取的RNA反转录为cDNA，然后依据上述试剂盒的说明书进行相对应基因的表达量检测，目的基因引物序列见表2。

表1 PS1TP2基因 siRNA序列

表2 目的基因引物序列

1.2.6Western blot检测AMPK、m-TOR、Bcl-2及Bax的表达水平 小干扰RNA、siNC转染后48 h蛋白裂解液裂解法提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度后进行Western blot,蛋白质样品进行电泳并保持湿度转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，于1×TBST 配制的5%脱脂牛奶封闭2 h；参照内参蛋白标记物切PVDF膜，4 ℃孵育一抗兔抗人AMPK(1∶1 000)、 m-TOR(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶500) 和 GAPDH(1∶1 000)过夜；次日清晨，1×TBST洗膜3次后，加入HRP标记山羊抗兔二抗 (1∶5 000),室温孵育2 h， 1×TBST洗膜3次，配制好显色液，于ECL下进行曝光显影并保存图像。使用IMAGEPROPLUS软件进行灰度分析。

2 结 果

2.1PS1TP2在不同肝细胞系中的基础表达量 RT-PCR结果显示，PS1TP2基因在L02细胞中mRNA表达水平明显低于HepG2细胞(P=0.004)，见图1。

图1 PS1TP2在两种肝细胞系中的表达水平比较

图2 两组HepG2细胞的增殖曲线比较

2.2两组HepG2细胞的增殖活性的比较 CCK-8实验结果显示，转染siRNA-PS1TP2的干扰组HepG2细胞的增殖速率明显慢于转染siNC的对照组(P=0.02)，见图2。

A ：两组HepG2细胞中AnnexinV+细胞数的变化；B：两组HepG2细胞中AnnexinV+细胞数的统计直方图；：两组细胞中AnnexinV+细胞数的比例柱状图

图4 两组HepG2细胞中AnnexinV+细胞数比较

2.3两组HepG2细胞中AMPK、mTOR蛋白的水平比较 Western blot结果显示，转染siRNA-PS1TP2干扰组HepG2细胞AMPK的蛋白水平明显高于转染 siNC的对照组(P=0.005)，而转染 siRNA-PS1TP2干扰组HepG2细胞mTOR水平则较转染siNC的对照组明显下降(P=0.03)，见图3。

2.4两组HepG2细胞中AnnexinV+细胞数比较 转染48 h后，流式细胞术检测结果表明，转染 siRNA-PS1TP2的干扰组AnnexinV+细胞数明显高于转染siNC的对照组，总凋亡率明显增加(P=0.02)，见图4。

2.5RT-PCR 检测Bcl-2和Bax基因表达水平 RT-PCR检测结果显示，转染siRNA-PS1TP2干扰组HepG2细胞 Bcl-2的mRNA水平明显低于转染siNC的对照组(P=0.005)，而转染siRNA-PS1TP2干扰组HepG2细胞Bax的mRNA水平则较转染 siNC的对照组明显升高(P=0.04)，见图5。

图5 两组HepG2细胞Bcl-2和Bax mRNA的表达水平

2.6PS1TP2干扰表达对Bcl-2、Bax蛋白表达及Bcl-2/Bax比值的影响 Western blot检测结果表明，转染siRNA-PS1TP2干扰组HepG2细胞 Bcl-2蛋白水平明显低于转染siNC的对照组(P=0.003)，转染siRNA-PS1TP2干扰组HepG2细胞Bax蛋白水平则较转染 siNC的对照组明显升高(P=0.02)，干扰组Bcl-2/Bax比值较对照组明显降低(P<0.05)，见图6。

A：Western blot检测；B：两组Bcl-2/Bax比值柱状图

图6 Bcl-2和Bax蛋白水平及PS1TP2对Bcl-2/Bax比值的影响

3 讨 论

PS1TP2是2004年本课题组应用基因芯片技术和抑制性消减杂交技术筛选Pre-S1蛋白反式激活靶基因和差异表达基因谱时发现的长度为573 bp的新型靶基因，并命名为PS1TP2(GenBank号：AY 426673)。在中国，HBV感染是HCC最主要的病因[9]。HBV病毒外膜蛋白包括S蛋白、pre-S1和pre-S2 3种成分，是嗜肝脱氧核糖核酸病毒科中哺乳动物病毒属一员。其中，pre-S1与DNA损伤，肝细胞氧化应激、变异及肝癌的发展密切相关[10]。本课题组前期筛选结果表明，PS1TP2可能参与细胞凋亡、细胞增殖与分化、肿瘤发生等多种生物学过程，说明PS1TP2可能在HBV相关肝病发展演变中发挥促进作用，对其机制的研究，以及对于进一步了解HBV相关肝病的发病机制具有非常重要的意义。

研究表明,被称作为“能量感受器”的AMPK在糖调节如肝糖原的分解与合成、肌糖原合成和脂类代谢如脂肪酸氧化、蛋白质与胆固醇形成、脂肪形成中发挥关键调控作用；在肿瘤细胞及其周围细胞中AMPK活性降低并伴随以上生理过程发生重要改变[11-12]。研究发现，AMPK在细胞的能量代谢及诱导细胞凋亡和周期停滞中发挥重要作用，影响细胞能量代谢，以适应和支持细胞增殖和生存[13-14]，因而AMPK成为了肿瘤预测和防治的新生物治疗靶点之一[15]。而m-TOR是STK进化上保守的一种，汇聚多条信号通路传递的信息，为许多通路聚集的交点，并对细胞生长、存活、增殖甚至自噬等过程产生对应的调控，所以被称作为细胞活动的“中央调控器”[16]；m-TOR存在m-TORC1和m-TORC2两种形式，m-TORC1通过促进或抑制蛋白质合成而影响细胞生长及个体发育的过程；m-TORC2能感知体内因子和能量变化，并参与糖代谢过程，从而干预肿瘤发生、发展的过程[17-18]。已有研究证实,AMPK的活化会伴随着m-TOR信号致癌作用靶点失活，影响肝能量代谢而影响肝癌细胞增殖[19]。在本实验中，与对照组相比，PS1TP2干扰组中AMPK水平明显升高，而m-TOR的蛋白水平明显降低，表明PS1TP2可能是经由AMPK-m-TOR途径活化从而抑制HepG2细胞的增殖。

本研究中AnnexinV/7-AAD结果显示，PS1TP2的表达下调加速 HepG2 细胞的凋亡。在细胞凋亡的调节中Bcl-2家族发挥着重要作用，Bcl-2/Bax比值被称作是启动细胞凋亡的分子总开关，与肿瘤细胞的存活密切相关。Bax是通过破坏线粒体的渗透性转换参与线粒体凋亡途径的代表性凋亡相关蛋白之一，可促进细胞色素C释放，诱导促进细胞凋亡的发展。沉默PS1TP2后，应用RT-PCR和Western blot法监测干扰组和对照组凋亡相应蛋白Bcl-2和Bax的表达程度，结果表明：通过沉默PS1TP2靶基因后，可下调凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比值，改变线粒体凋亡途径的下游凋亡级联效应并加速HepG细胞凋亡。

综上所述,干扰PS1TP2通过诱导AMPK的活化，伴随着m-TOR信号致癌作用靶点失活和下调Bcl-2/Bax比值，从而干扰HepG2细胞的增殖和凋亡过程，参与HBV的致病机制。但PS1TP2通过哪些调控水平来实现线粒体凋亡的作用，以及其确切的细胞内信号传导机制目前仍不清楚。PS1TP2能否通过其他凋亡途径影响肿瘤细胞的凋亡，如死亡受体途径和内质网应激途径，并且这些途径是否与线粒体凋亡途径相互作用还需待进一步深入研究。随着PS1TP2作用机制的进一步研究，PS1TP2或有望能在肝癌预测和治疗中发挥重要作用。