王保永，夏艳丽，肖鸿丽，闫一帆，赵巧飞，张 瑜，陈宏伟

(郑州大学附属洛阳中心医院消化内科，河南洛阳 471000)

miRNA是一类短的(18～25核苷酸)非编码RNA,可结合到靶基因并导致目标mRNA降解或翻译抑制使靶蛋白的表达水平降低[1-2]。miR-138在胆囊癌[3]、食道癌[4]等肿瘤中发挥抑瘤作用。肝癌细胞中miR-138被证实可直接靶向波形蛋白mRNA上或下调细胞周期蛋白D3(CCND3)及波形蛋白[5-6]，提示其在肝癌发生和发展中可能起着重要作用，但miR-138如何影响肝癌细胞的迁移及入侵尚未明确。本试验旨在研究miR-138如何通过波形蛋白和CCND3对肝癌细胞的迁移及增殖发挥作用，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料

1.1.1研究材料 选取22例肝癌组织和癌旁组织作为研究材料，包括11例组织病理学确诊的肝癌组织及11例相应的癌旁组织。其中，男7例，女5例，平均年龄57.3岁。标本保存于-80 ℃待用。所有患者术前未进行过放、化疗等抗肿瘤治疗，并签署知情同意书。本研究已经通过了本院医学伦理委员会的审批。肝癌细胞系HepG2、HHCC、HUH7、BEL-7402及正常肝细胞系HL-7702均从美国菌种保藏中心(ATCC)购买。

1.1.2试验试剂及器材 研究中所使用的miR-138 RT-PCR引物委托上海生工生物有限公司进行合成。引物序列如下，miR-138：上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGAGCTGGTGTTTGAATCA-3′，下游引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGC GGCCTG-3′。靶向miR-138的模拟物和抑制剂：委托广州锐博生物公司进行设计并合成。序列如下,miR-138模拟物(mimics)：5′-AGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCG-3′；miR-138抑制剂(inhibitor):5′-CGGCCUGAUUCACAACACCAGCU-3′。

主要试剂：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ购自大连宝生物公司；RNeasy Plus Micro Kit购自美国QIAGEN公司；SuperScript®Ⅳ试剂盒、脂质体2000购自美国Invitrogen公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自德国Millipore公司；抗CCND3一抗、抗波形蛋白一抗及goat anti-rabbit 免疫球蛋白G(IgG)-辣根过氧化物酶(HRP)二抗购自美国Abcam公司；ECL化学发光剂购自美国Thermo Fisher Scientific公司；Dulbecco′s Modified Eagle 细胞培养基、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及转染 正常肝细胞系HL-7702及肝癌细胞系HepG2、HHCC、HUH7和BEL-7402均采用DMEM培养基培养，在培养基中添加10% FBS,100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素，并将细胞置于含5%CO2,湿度为95%的细胞培养箱于37 ℃条件下培养。行转染操作前24 h，将细胞覆盖在不含抗生素的500 μL生长培养基上，从而使得细胞在进行转染操作时达到30%～50%的融合；按照LipofectamineTM2000的说明书所述步骤进行操作。分别将空脂质体(作为对照)、模拟物及抑制剂转染至HepG2肝癌细胞。

1.2.2RT-PCR 试验应用RNeasy Plus Micro Kit试剂盒对癌旁肝组织、肝癌组织及细胞的总RNA进行提取。应用SuperScript®Ⅳ试剂盒将RNA进行反转录。反应条件：65 ℃ 5 min，50 ℃ 10 min，80 ℃ 10 min。1 μL RNA酶，37 ℃ 20 min孵育后,去除RNA。产物用于下一步PCR反应。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒行RT-PCR检测miR-138的表达。反应条件：95 ℃ 5 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 60 s，4 ℃保温，共进行40个循环。采用 2-ΔΔCt法分析各基因miR-138表达，反应设置3个无模板的阴性对照，计算循环阈值(Ct)，并以U6为内参计算标准化Ct值，即ΔCt=CtmiR-138-CtU6。为了方便计算，miR-138的表达水平以2-ΔΔCt计算。

1.2.3Western blot 采用Western blot的方法检测波形蛋白 和 CCND3的表达。离心收集细胞，在细胞中加入RIPA buffer细胞裂解液，反复离心收集上清液。利用牛血清清蛋白(BCA)试剂盒对所得上清液中总蛋白水平进行测定。行BSA蛋白标准曲线构建及样品蛋白浓度测定；通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳分离蛋白后转移至硝酸纤维素膜上，转膜及抗体孵育后，按照ECL化学发光试剂盒说明书对PVDF膜进行发光显色。

1.2.4细胞增殖活性检测 向96孔反应板中注入细胞悬浮液(每孔100 μL)。将孔板置入潮湿环境中(37 ℃,5%CO2)进行预培养。孔板中各孔添加10 μL CCK-8溶液并孵育1～4 h。使用酶标仪测定各样品的光密度值(OD值，450 nm)。利用EdU试剂盒对细胞活力进行测定。种适当数量细胞，用DMEM完全细胞培养基培养过夜，并用DMEM细胞培养液稀释EdU溶液(1∶1 000)。按照试剂盒说明书测试并行荧光显微镜观察。

1.2.5细胞创伤愈合试验 将一定密度的细胞接种至24孔细胞培养板并培养24 h直至达到70%～80%融合度，运用灭菌的200 μL移液枪枪头在培养基表面划痕。冲洗脱落细胞，孔板添加新鲜培养基并培养细胞48 h。磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞2次，固定后显微镜观察不同视野的单层细胞，拍照后划痕距离应用ImagJ软件进行测量并计算均值及方差。

1.2.6细胞迁移试验 将传代2～3次且80%融合的细胞在适宜的无血浆培养基中培养18～24 h，使用无菌PBS清洗细胞2次。进行离心操作并获得细胞沉淀(1 500 r/min,10 min)。重悬细胞并进行细胞计数，使得细胞数量为(0.5～1.0)×106/mL。用钳子夹取Transwell小室，往Transwell小室中添加300 mL上述细胞悬浮液，下室中则加入500 mL不含血浆的培养基，37 ℃条件下在5%CO2培养室培养24 h。用移液枪从上室中剩余的细胞悬浮液吸出，将Transwell小室移入含400 μL 细胞染色液的洁净孔板内，室温培养20 min，多次漂洗Transwell小室，用1根棉签拭子将Transwell小室里侧的非渗移性细胞层轻轻擦除。将染色的Transwell小室转入内含200 μL 提取缓冲液的清洁孔板内，轻轻摇晃倾斜Transwell小室，重复10次，尽量将染色的细胞从其底部取出，并将Transwell小室从孔板内移出。100 μL 细胞悬液转入适于比色测定的96孔微量滴定板中，在显微镜的明亮视野中对阳性细胞进行观察计数。

2 结 果

2.1miR-138 mRNA在肝癌组织及癌旁组织中的表达 RT-PCR检测肝癌组织及癌旁组织中miR-138表达显示，与癌旁组织相比，miR-138的mRNA在肝癌组织中的表达水平明显降低(P<0.01)，见图1。

2.2miR-138 mRNA在正常肝细胞系及肝癌细胞系中的表达 与正常肝细胞系HL-7702相比，miR-138的mRNA表达水平在肝癌细胞系HepG2、HUH7、HHCC及 BEL-7402中均明显降低(P<0.01)，见图2。

图2 正常肝细胞系及肝癌细胞系中的miR-138 mRNA表达水平

图3 miR-138 mimics和inhibitor干扰后miR-138的表达水平

图4 CCK-8法检测干扰miR-138后的肝癌细胞活力

2.3miR-138 mimics及inhibitor对肝癌细胞系miR-138的表达的影响 与对照相比，当转染miR-138 inhibitor，miR-138的表达显著降低(P<0.01)；转染miR-138 mimics时miR-138的表达显著升高(P<0.01)，见图3。

A：各组细胞创伤愈合能力比较；B:各组细胞迁移能力比较

图6 干扰miR-138的肝癌细胞迁的柱状图

A：Western blot蛋白图；B:各组波形蛋白和CCND3的蛋白表达量柱状图

图7 Western blot检测结果

2.4CCK-8法检测干扰miR-138的肝癌细胞活力 当类似物转染72 h后，相较于对照，HepG2细胞的增殖能力降低(P<0.01)；当miR-138 inhibitor转染72 h后，HepG2细胞的增殖能力升高(P<0.01)，见图4。

2.5干扰miR-138对肝癌细胞迁移的影响 当miR-138 mimics 转染HepG2细胞，相较于对照，HepG2细胞的创伤愈合能力较弱，迁移能力明显降低(P<0.01)；当miR-138 inhibitor 转染HepG2细胞，相较于对照，HepG2细胞的创伤愈合能力增强，迁移能力明显升高(P<0.01)，见图5、6。

2.6干扰miR-138的miR-138相关靶蛋白的表达水平比较 Western blot结果表明，当miR-138 mimics转染HepG2细胞，相较于对照，波形蛋白和CCND3的表达水平降低(P<0.01)；当miR-138 inhibitor 转染时，波形蛋白和 CCND3的表达水平升高(P<0.01)，见图7。

3 讨 论

miRNA是具有内源性、进化保守性，天然大量存在且相对稳定的短链(约22个核苷酸)非编码RNA分子，在多数生物学及病理学过程中的后转录阶段发挥了基因调控的作用[7]。研究表明，大约30%的蛋白质的编码基因受miRNA的调控，通过碱基互补原则结合到目的mRNA上或通过结合到5′端非翻译区(3′UTR)的非互补位点上并进行进一步的调控，从而在翻译水平上控制基因的表达[7]。据统计，超过45 000个miRNA结合位点存在于人类的3′UTR，并且超过60%的人类蛋白质编码基因可能受多个miRNA调控[8]。miRNA在细胞核中被RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ转录成为长链的、加帽的聚腺苷酸前体，被称之为初级微小RNA(pri-miRNA)。核输出受体输出蛋白5/Ran GTP将miRNA前体运输到细胞质中[9],然后被RNase Ⅲ内切酶Dicer沿着转录活性相应的RNA结合蛋白(TRBP)进行进一步加工，成为22个核苷酸双链RNA结构[9]。这个miRNA复合体被解离为成熟的单链形式，结合到RNA诱导的沉默复合体(RISC)上，该复合体可引导与目的mRNA的互补3′UTR端结合而发挥作用。

miR-138作为miRNA前体家族之一，可在多种癌症中起抑瘤作用，比如喉癌[10]、口腔细胞癌[11]、结肠癌[12]、非小细胞肺癌[13]等。研究表明，在肝癌中miR-138表达下调并作用于CCND3，可诱导细胞周期停滞[5]，但其详细的生物学机制尚未被完全阐明，miR-138影响肝细胞肝癌增殖、迁移和入侵机制仍需要继续探索。本试验结果提示，与癌旁组织及正常肝细胞系相比，miR-138表达在肝癌中和肝癌细胞系中明显降低。当miR-138 mimics转染肝癌细胞后，HepG2细胞的活力降低，创伤愈合能力较弱，迁移能力明显降低，经Western blot检测，波形蛋白和CCND3的表达水平降低。转染miR-138 inhibitor后，HepG2细胞的增殖升高，肝癌细胞的创伤愈合能力和迁移能力提升，与此同时，波形蛋白和CCND3的表达水平升高。本试验证实了通过调控miR-138在HepG2细胞中的表达可以调控肝癌细胞的增殖、迁移能力及创伤愈合能力，并进一步调节miR-138介导的信号通路，即miR-138通过调节其相关靶蛋白波形蛋白和CCND3的表达来达到调控肝癌细胞的增殖及迁移能力的目的。

波形蛋白是细胞骨架的主要组成成分，甚至被视为癌变过程中进行上皮间质转化细胞的标记。在波形蛋白mRNA序列中可鉴定出3段miR-138的靶向序列。有研究表明，应用荧光素酶报告基因试验证实了miR-138可直接靶向波形蛋白mRNA上[6]。细胞周期受细胞周期素依赖性激酶(CDK)家族和其活性分子(细胞周期素)的调控。细胞从G1到S期的相变最初受细胞周期素D家族成员(CCND1,CCND2和CCND3)与CDK4/CDK6复合体和细胞周期素E家族成员(CCNE1和CCNE2)与CDK2复合体的调控。已有两项研究发现在鼻咽癌和HCC中miR-138可分别靶向CCND1及CCND3[5,14]，且发现在鼻咽癌和肝癌中miR-138的表达频繁下调，CCND1和CCND3的表达与miR-138的表达成反比，并在进一步的试验中证实了miR-138可直接特异靶向结合CCND3 mRNA[5]，以上研究均提示波形蛋白和CCND3在肿瘤细胞增殖中发挥重要的作用。本试验证实，通过调节miR-138的表达，可调节波形蛋白和CCND3的表达，而波形蛋白与CCND3在细胞增殖活性发挥重要的作用，推测miR-138通过波形蛋白及CCND3进一步调节肝癌的进展。本试验结果也证实了在调节miR-138表达后，肝癌细胞的增殖活性、细胞迁移能力发生了改变，该结果与推测一致，提示miR-138通过其靶基因波形蛋白和CCND3，可调节HepG2细胞的增殖活力及迁移能力。也有类似的研究表明DBH-AS1经由细胞内黏着斑激酶(FAK)/Src/细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)途径靶向miR-138促进肝癌的发生[15]。miR-138同时也可在学习记忆、心肌保护及骨生长等机制中发挥重要的作用[16-18]。

综上所述，本研究果证实了miR-138是通过何种靶基因来达到对肝癌细胞的增殖、迁移、入侵的影响，结果提示miR-138可能是一个多功能的调节子，在HCC发展中起主要作用。因此，miR-138可能成为治疗肝癌的靶基因位点，可抑制肝癌的侵袭。