郭志鹏，冯长松，张靖雪，王苗利，曲根，刘建宇，管永卓，张晓婷，郭玉霞*，严学兵

(1.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002；2.河南省农业科学院畜牧所，河南 郑州 450002；3.扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州 225000)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界上栽培最早、种植面积最大、利用价值最高的一种多年生优质豆科牧草[1]，有“牧草之王”的美誉[2]。其在农牧业生产中有着不可替代的作用[3]。我国是畜牧大国，对苜蓿草的需求很大，2015年我国的苜蓿商品干草产量为123万t，进口苜蓿为121万t[4]。农业部发布的苜蓿产业“十三五”规划提出，到2020年，全国优质苜蓿产量将达到540万t[5]。随着我国苜蓿种植面积的不断增加以及种植年限的延长，苜蓿病毒病害的发生越来越严重，已成为限制苜蓿产业发展的重要原因之一[6]。目前国内对苜蓿病毒病的研究甚少，韩玉静等[7]、张丽[8]、王瑜等[9]、张蓉等[10]、杨雨翠[11]和张芯伪[12]仅仅调查了苜蓿花叶病的田间发病率。周其宇等[6]通过病原检测对侵染苜蓿的苜蓿花叶病毒、白三叶(Trifoliumrepens)花叶病毒、菜豆(Phaseolusvulgaris)黄花叶病毒和豇豆(Vignaunguiculata)花叶病毒进行了鉴定，并测定了这4种病毒的寄主范围。南志标[13]研究了苜蓿花叶病对苜蓿田间产量和质量的影响。国外的研究发现侵染苜蓿的病毒至少有31种[14-20]。

以往在苜蓿病毒病的研究中，多是在病毒种类的鉴定上进行试验，有关苜蓿不同品种对病毒病的抗性研究尚未见报道。目前，国内栽培的苜蓿品种繁多，不同地区不同品种的抗性表现不同，在引种苜蓿时，评价不同品种苜蓿对病毒病的抗性是很有必要的，以筛选适应本地种植的优质高产的苜蓿品种。本研究利用小RNA深度测序技术结合RT-PCR技术检测鉴定30个紫花苜蓿品种中的病毒种类，并测定各紫花苜蓿品种的发病率、病情指数、相对株高、相对单株干重、相对茎秆直径、相对叶面积、相对叶长和相对叶宽，比较各紫花苜蓿品种的抗性表现，筛选出抗性较强的品种，同时测定病毒病对各紫花苜蓿品种茎叶比的影响。并分析病情指数等7个性状之间的相关性，基于这7个性状表现，对30个紫花苜蓿品种进行聚类分析，以期为进一步开展苜蓿种质资源的评价和利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于河南省新乡市原阳县平原示范区河南现代农业研究开发基地，地处黄河流域下游，地下水资源丰富，常年平均地下水位在5～8 m，属淡水，pH值为6～8，适宜农作物灌溉；土质为砂壤土，土壤有机质含量高(10 g·kg-1左右)；属暖温带季风气候，春季干旱风沙多，夏季炎热雨集中，秋季光足温差大，冬季干冷季节长。年平均气温14.4 ℃，全年无霜期224 d，全年日照1938 h，灌区冬春季盛行东北风、西北风，夏秋季盛行东南风、南风，年平均风速为3.4 m·s-1，瞬时最大风速为24 m·s-1。年季节变率较大，旱涝交替出现，但旱多于涝，雨量多集中在6-9月，占全年降水量的71%左右。

1.2 田间实验设计

试验地为河南省新乡市原阳县平原示范区河南现代农业研究开发基地内的一块连片的矩形平整地块，播种前统一翻耙、整地，并分好区块。于2013年9月随机播种30个紫花苜蓿品种(表1)，每个品种种植3个区块，每个区块占地面积2 m×5 m，各区块间相隔0.5 m，种植过程中正常管理，不施肥、不喷洒农药，仅进行人工除草。于2017年4月25日对苜蓿各项指标进行测定。

1.3 测定指标及方法

1.3.1发病率和病情指数测定 采用“W”形调查法，每个苜蓿品种调查5个样方，每个样方面积为0.71 m×0.71 m，每个样方调查20株，共100株，记录所调查苜蓿植株发病数，计算发病率，根据苜蓿病毒病的分级标准(表2)计算病情指数[6]，具体如下：

发病率病情指数

表 2 苜蓿病毒病分级标准Table 2 Classification standard of alfalfa virus disease

1.3.2相对株高、相对单株干重和相对茎秆直径的测定 每个品种选取有代表性的健康植株和发病植株各6株，测株高(地面量至最高处垂直距离)、单株干重(将单株鲜样放入信封袋中，在烘箱中105 ℃杀青25 min，65 ℃烘干24 h后测其干重)和茎秆直径(每株苜蓿从顶部下数第4节茎秆的中部测其直径)。根据如下公式计算相对株高、相对单株干重和相对茎秆直径：

1.3.3相对叶面积、相对叶长、相对叶宽和相对叶茎比的测定 选取植株从顶部下数第2节处的三小叶，用数字式叶面积仪(ADC生物科学有限公司，设备类型：AM300-002，序列号：31848)测其叶面积、叶长和叶宽，每个苜蓿品种选取健康植株和发病植株各9株。根据如下公式计算相对叶面积、相对叶长和相对叶宽：

刈割留茬高度4 cm，每个品种取健康植株和发病植株各500 g鲜草进行茎叶分离，分别称重，在烘箱中105 ℃杀青25 min，65 ℃烘干24 h后称重，计算叶茎比。根据如下公式计算相对叶茎比：

1.4 苜蓿病毒种类的分子生物学验证

将调查采集的30个紫花苜蓿品种病叶样用锡箔纸包被并做好标记，立即放入液氮速冻，回到实验室后立即保存在-80 ℃冰箱备用，用北京艾德莱生物科技有限公司的EASY spin植物micro RNA快速提取试剂盒，分别提取30个紫花苜蓿品种的病样总RNA，并送至北京百迈客生物科技有限公司进行小RNA深度测序。通过对测序数据的过滤、拼接、BLAST分析初步筛查病毒相关序列，随后利用反转录PCR扩增和克隆测序技术进一步确定病毒种类。

1.5 数据统计分析

采用Microsoft Excel进行数据的处理，采用SPSS 22.0软件对数据进行方差分析和多重比较[21]；利用DPS 6.55软件对30个紫花苜蓿品种的部分性状进行相关性分析和系统聚类分析。

2 结果与分析

2.1 苜蓿病毒病的田间症状类型

田间调查发现，苜蓿感染病毒病原后，主要有以下症状类型(图1)。黄斑花叶：沿叶脉产生相间的黄色条点，严重的出现黄条斑，并产生黄条状或者不规则形状花叶(图1A)；斑驳花叶：叶面整体凹凸不平，出现黄绿斑点或者黄绿相间花叶(图1B)；黄化：植株叶面整体黄化发亮，叶脉也出现黄化(图1C)；皱缩：叶片无规则扭曲皱缩，不能展平，叶片颜色并未发生变化(图1D)；花叶皱缩：叶面无规则扭曲皱缩，不能展平，叶片出现黄色斑点或者花色条纹，植株出现褪绿现象(图1E)；丛簇矮化：植株明显矮小，中上部叶片无规则扭曲皱缩，不能展平，有的皱缩叶片有坏死征兆(图1F)。

图1 苜蓿病毒病田间症状类型Fig.1 Symptom types of alfalfa virus disease in the field A: 黄斑花叶Macular mosaic; B: 斑驳花叶Mottle mosaic; C: 黄化Etiolation; D: 皱缩Shrinkage; E: 花叶皱缩Mosaic shrinkage; F: 矮化Dwarf; G: 健康Healthy.

2.2 苜蓿样品病毒种类的检测

30个苜蓿品种病样经过小RNA测序、过滤、拼接后，将拼接片段比对至NCBI病毒核酸数据库，BLASTn初步比对到3种病毒：苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaic virus, AMV)、苜蓿卷叶病毒(alfalfa leaf curl virus, ALCV)和苜蓿矮缩病毒(alfalfa dwarf virus, ADV)。之后利用这些拼接片段设计引物，利用RT-PCR和克隆测序技术进一步验证侵染苜蓿的病毒种类，最终只有AMV扩增出特异片段(上游引物-F序列5′-3′：AACGGTGCGTATAGATGCCG，下游引物-R序列5′-3′：TTAATCCACCCAGTGGAGGTCA)，该特异片段大小为876 bp，其中包含AMV的外壳蛋白基因组全序列(图2)。之后将该片段克隆测序并与NCBI中的AMV外壳蛋白基因(GenBank数据库登录号：MF075254.1)进行同源性比对，其同源性均超过了95%，因此可以判定这30个苜蓿品种均受到了苜蓿花叶病毒的侵染。

图2 PCR验证AMV的存在Fig.2 PCR validation for the presence of the AMV M代表DNA分子量标准；1～30分别代表利用F和R引物对对30个苜蓿品种的病样扩增得到的特异条带。M represents DNA marker (DL 1000 DNA Marker). Lane 1 to 30 represent PCR using primers of F and R of 30 alfalfa varieties, respectively.

2.3 苜蓿病毒病的田间发病情况

30个苜蓿品种的田间发病率均超过了90%(表3)，除大富豪外的其余29个苜蓿品种的田间发病率均超过了95%，惊喜、WL-903、三得利、金皇后、猎人河、维多利亚、飞马、爱菲尼特、赛迪和四季旺的田间发病率均为100%，显著高于WL-525、和田大叶和大富豪(P<0.05)。30个苜蓿品种的病情指数范围为31.53～55.50，从病情指数上来看，不同苜蓿品种间的抗病性有所不同，其中，顶点的抗病性最强(病情指数为31.53)，惊喜的抗病性最弱(55.50)，显著弱于除WL-903、敖汉、8920MF、兼用苜蓿、苜蓿王和皇后2000外的其余23个苜蓿品种(P<0.05)；丰叶721、盛世、阿迪娜和大富豪的抗病性较强(33.95～37.19)，WL-903、敖汉、8920MF、兼用苜蓿、苜蓿王和皇后2000的抗病性较弱(46.31～52.51)，其余18个苜蓿品种的抗病性中等。

2.4 苜蓿病毒病对30个紫花苜蓿品种表观指标的影响

30个苜蓿品种的表观指标与对照相比有所不同，不同品种间的同一指标也各有差异(表4)。从相对株高来看，30个苜蓿品种均低于对照，其中，敖汉的抗病性最强(相对株高为0.93)，显著强于除和田大叶、兼用苜蓿、苜蓿王、丰叶721和大富豪外的其余24个苜蓿品种(P<0.05)，赛迪的抗病性最弱(0.43)，显著弱于除8920MF外的其余28个苜蓿品种(P<0.05)；和田大叶、兼用苜蓿、苜蓿王、丰叶721和大富豪的抗病性较强(0.80～0.92)，8920MF、丰宝、WL-525、阿尔冈金、盛世和先行者的抗病性较弱(0.47～0.64)，其余17个苜蓿品种的抗病性中等。

从相对单株干重来看，病毒病对各品种苜蓿的影响较大，除了射手2号、飞马、猎人河和皇后2000外的其余26个苜蓿品种的相对单株干重均低于0.60，其中，射手2号的抗病性最强(相对单株干重为0.91)，显著强于除飞马和猎人河外的其余27个苜蓿品种(P<0.05)，赛迪的抗病性最弱(0.18)；飞马的抗病性较强(0.74)，猎人河、皇后2000、德宝、苜蓿王和大富豪的抗病性中等(0.52～0.68)，其余22个苜蓿品种的抗病性较弱，其相对单株干重均低于0.50。

从相对茎秆直径来看，射手2号的抗病性最强(相对茎秆直径为1.05)，显著强于除WL-903和维多利亚外的其余27个苜蓿品种(P<0.05)，8920MF和盛世的抗病性最弱(均为0.60)；WL-903、维多利亚、飞马、皇后2000和和田大叶的抗病性较强(0.87～0.92)，THG、赛迪、丰宝、爱菲尼特、兼用苜蓿、WL-525、敖汉、阿迪娜和三得利的抗病性较弱(0.63～0.69)，其余13个苜蓿品种的抗病性中等。

表3 30个苜蓿品种的病毒病发病情况Table 3 Incidence of alfalfa virus disease of 30 alfalfa varieties

注：同列不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著。下同。

Note：Values within the same column followed by the different lowercases are significantly different atP<0.05. The same below.

从相对叶面积来看，射手2号的抗病性最强(相对叶面积为0.99)，显著强于除维多利亚和德宝外的其余27个苜蓿品种(P<0.05)，敖汉的抗病性最弱(0.33)，显著弱于除胖多、THG、丰宝、兼用苜蓿和WL-903外的其余24个苜蓿品种(P<0.05)；维多利亚、德宝和盛世的抗病性较强(0.80～0.97)，胖多、THG、WL-903、丰宝、兼用苜蓿、先行者和阿迪娜的抗病性较弱(0.37～0.49)，其余18个苜蓿品种的抗病性中等。

30个苜蓿品种间的相对叶长和相对叶宽的差异与叶面积类似，从相对叶长来看，德宝、射手2号、苜蓿王、四季旺、飞马、和维多利亚的抗病性较强(0.82～0.95)；敖汉、胖多、先行者、丰宝、WL-903和兼用苜蓿的抗病性较弱(0.44～0.58)。从相对叶宽来看，维多利亚、射手2号、盛世、WL-525、金皇后、德宝、飞马、和田大叶和8920MF的抗病性较强(0.90～1.18)；THG、胖多、兼用苜蓿、猎人河、敖汉、丰宝和WL903的抗病性较弱(0.65～0.74)。

2.5 苜蓿病毒病对30个紫花苜蓿品种叶茎比的影响

30个苜蓿品种的相对叶茎比与对照相比，差异各有不同(图3)，有21个苜蓿品种的相对叶茎比高于对照，其中，丰宝(1.79)、赛迪(1.54)和先行者(1.40)的相对叶茎比极显著高于对照(P<0.01)，惊喜(1.31)、大富豪(1.30)、WL-903(1.29)、维多利亚(1.28)、WL-525(1.28)和盛世(1.28)的相对叶茎比显著高于对照(P<0.05)，其余12个苜蓿品种的相对叶茎比为1.00～1.24，与对照相比差异不显著(P>0.05)；剩余的9个苜蓿品种的相对叶茎比均低于对照，其中兼用苜蓿(0.59)的相对叶茎比极显著均低于对照(P<0.01)，其余8个苜蓿品种的相对叶茎比为0.75～1.00，与对照相比差异不显著(P>0.05)。

表4 苜蓿病毒病对30个紫花苜蓿品种表观指标的影响Table 4 Effect of alfalfa virus disease on plant appearance index of 30 alfalfa varieties

2.6 不同苜蓿品种农艺性状间的相关分析

由表5可知，相对单株干重与相对茎秆直径、相对叶面积、相对叶长的相关系数分别为0.61、0.37和0.41，达到显著正相关(P<0.05)，其中单株干重与相对茎秆直径达到极显著正相关(P<0.01)；相对茎秆直径与相对叶面积的相关系数为0.38，达到显著正相关(P<0.05)；相对叶面积与相对叶长、相对叶宽的关系数均为0.87，达到极显著正相关(P<0.01)；相对叶长与相对叶宽的相关系数为0.54，达到极显著正相关(P<0.01)；病情指数与其余6个农艺性状间的相关性均不显著(P>0.05)。

图3 苜蓿病毒病对30个苜蓿品种相对叶茎比的影响Fig.3 Effect of alfalfa virus disease on plant appearance index of 30 alfalfa varieties *表示在P<0.05水平上显著差异，**表示在P<0.01水平上极显著差异。* indicates significant difference at P<0.05 level, ** indicates significant difference at P<0.01 level.

性状CharacterX2X3X4X5X6YX10.240.27-0.14-0.07-0.110.00X20.61∗∗0.37∗ 0.41∗ 0.180.05X30.38∗ 0.300.340.02X40.87∗∗0.87∗∗-0.21X50.54∗∗-0.20X6-0.22

X1:相对株高Relative plant height;X2:相对单株干重Relative dry weight per plant;X3:相对茎秆直径Relative stem diameter;X4:相对叶面积Relative leaf area;X5:相对叶长Relative leaf length;X6:相对叶宽Relative leaf width;Y:病情指数Disease index.*:P<0.05;**:P<0.01.

2.7 不同品种之间7个性状的聚类分析

将各苜蓿品种的病情指数、株高、单株干重、茎秆直径、叶面积、叶长和叶宽分别作为指标，由于各指标的调查量纲不同，首先对各指标的平均数进行标准化处理，采用系统聚类，聚类距离运用欧氏距离，采用最短距离法，对30个苜蓿品种进行聚类分析(图4)。在2.60距离水平上，30个苜蓿品种聚类分为2个组群，第一组群只有射手2号一个苜蓿品种，占3.33%；第二组群有29个苜蓿品种，占96.67%。在2.40距离水平上，第二组群又可以分为3个亚群，以此类推。从聚类结果可以看出，综合抗病性较强的品种射手2号与其他苜蓿品种的亲缘关系较远，利用射手2号品种与其他苜蓿品种杂交可能产生较大的杂交优势。

3 结论与讨论

田间调查表明，30个苜蓿品种的田间发病率为94.07%～100%，说明在田间这些苜蓿品种对病毒病并无绝对抗性。本研究调查苜蓿病毒病的田间发病率和病情指数(31.53～55.50)均高于周其宇等[6]的田间调查结果(田间发病率为16.08%～43.33%，病情指数为6.25～26.08)。蓟马、蚜虫、传粉昆虫等均可传播病毒病[22]，蓟马危害苜蓿后可加重苜蓿的病害表现[6]，本研究试验地周围杂草较多，夏季虫害较为严重，伴随着害虫的繁殖，将更加有利于苜蓿病毒病的传播，加重病情[23]，这可能是影响调查结果的一个主要原因；另外苜蓿病害随着种植年限的增长而加重[13]，本研究的苜蓿品种均为种植的第5个年头，种植年限较长，加重了病害程度的积累，这可能是造成此结果的另一个主要原因。

图4 30个苜蓿品种7个性状遗传关系聚类分析Fig.4 Dendrogram of genetic affinity based on the 7 characters analysis in 30 alfalfa varieties

从各指标的相关分析结果可以看出，供试苜蓿品种的病情指数和株高、单株干重、茎秆直径、叶面积、叶长、叶宽均无显著相关性，史凤玉等[24]在野生大豆(Glycinesoja)病毒病的调查中发现病情指数和株高、叶色、叶形、单荚粒数、茎色、茸毛色等农艺性状均无显著相关性，本研究结果与此类似。在苜蓿病毒病对苜蓿品种叶茎比的影响中发现，30个苜蓿品种中，21个苜蓿品种的叶茎比高于对照，9个苜蓿品种的叶茎比低于对照，可能是病毒侵染苜蓿后，对不同品种苜蓿叶和茎的影响不同，仅从本研究可以看出病毒病对多数苜蓿品种茎的抑制作用要强于叶，具体原因有待于进一步研究。

史凤玉等[24]、彭冠云[25]、陈博等[26]对病毒病的抗性评价中仅以病情指数作为评价指标，采用单一指标来评价苜蓿的抗病性存在不稳定性和片面性，用多个指标进行综合评价才较为可靠[27]。根据病情指数、株高、单株干重、茎秆直径、叶面积、叶长和叶宽指标的综合评定，射手2号对苜蓿病毒病的抗性较强，飞马、猎人河、德宝、大富豪、丰叶721和皇后2000对苜蓿病毒病的抗性一般，其余23个苜蓿品种对苜蓿病毒病的抗性较差，分别占供试品种的3.33%，20.00%和76.67%。这与大豆在病毒病的抗性结果类似[28]，也与苜蓿对其他叶部病害的抗性结果类似[29-30]，大多数品种属于高感或者感病，少数品种具有较好的抗性，缺少高抗品种。

将遗传距离较远的2个材料进行杂交，可能获得较大的杂种优势[31]。通过聚类分析的方法可直观看出各品种间的距离[32]。本研究通过对各苜蓿品种的7个农艺性状的聚类分析发现，抗病毒病较好的射手2号与其他苜蓿品种的亲缘关系较远，在苜蓿育种中，通过射手2号与其他农艺性状表现良好的苜蓿品种进行杂交，可能拓宽苜蓿遗传育种的种质，选育出质优高产抗病的苜蓿品种。