许璨 刘厂辉 彭旷

南华大学附属第一医院心内科（湖南衡阳421001）

川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP）是从活血化瘀中药川芎中提取出来的吡嗪类生物碱，临床上常用于治疗冠心病、心绞痛、心肌梗死等疾病［1］。大量的药理学实验证明川芎嗪能抑制缺血再灌注损伤所致心律失常、缩短心律失常持续时间、降低室颤和室速的发生率［2］。吕磊等［3］研究发现，川芎嗪预处理明显降低心肌细胞凋亡指数及Caspase-3活性、降低Bax mRNA的表达水平，增加Bcl-2 mRNA和磷酸化Akt的表达水平。王万铁等［4］研究发现，川芎嗪通过减少心肌细胞MAO活性，提高线粒体COX活性，从而实现减少线粒体外膜损伤和内膜膜电位，减少心肌细胞凋亡［4］。尽管如此，川芎嗪存在易升华、体内半衰期短、生物利用度低等系列问题［5］。黄鹏等［6］研究了磷酸川芎嗪滴丸在人体内的药代动力学，发现磷酸川芎嗪滴丸在人体内代谢很快，t1/2约为1 h，临床上需要多次给药才能维持血药浓度。故需构建一种载药系统解决川芎嗪的上述问题，同时将药物靶向聚集在缺血心肌部位，便于药物进入线粒体发挥药理作用。聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物（polyethyleneglycol-polylacticacidglycolicacid，PEGPLGA）具有亲水端PEG，亲脂端PLGA，两者连接在一起形成了双亲性高分子药用材料，在水溶液中可组装形成纳米胶束，外周PEG可以在体内长循环，延长药物的半衰期，内核PLGA为亲脂性高分子，能与脂溶性小分子融合在一起，故可承载脂溶性成分［7］。目前，PEG-PLGA纳米胶束主要用于递送肿瘤药物［8］，缺血心肌部位也存在与肿瘤相似的炎症细胞浸润，文献报道PEG-PLGA在缺血心肌部位也具有良好的EPR效应［9］，因而本研究于2017年12月至2018年4月采用PEG-PLGA承载川芎嗪，制备川芎嗪PEG-PLGA纳米胶束，通过考察川芎嗪PEG-PLGA纳米胶束在急性缺血心肌模型大鼠组织分布，探索该载药系统的心脏靶向性。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂PEG-PLGA（冰河生物科技（上海）有限公司，MW=3 000 Da），川芎嗪原料药（南京郎泽医药科技有限公司，纯度≥98%，批号：20171022），盐酸川芎嗪对照品（中国食品药物检定研究院，批号：110817-201608，纯度≥98%），6-甲基香豆素内标物（中国食品药物检定研究院，批号：520003-201301，纯度≥98%），色谱纯甲醇购自美国TEDIA试剂公司，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器JEM-2100 Plus透射电子显微镜（日本电子株氏会社），LC-20 AT高效液相色谱仪（日本岛津），BSA224S电子分析天平（德国赛多利斯），TGL20MW台式大容量高速冷冻离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）。

1.3 动物D雄性大鼠，购于南华大学实验动物中心，合格证号HUNANSlk 20180511。

1.4 方法

1.4.1 川芎嗪PEG⁃PLGA纳米胶束的制备精密称取川芎嗪8 mg、PEG-PLGA 80 mg，加入30 mL色谱二氯甲烷使其完全溶解，抽真空，再于40℃温度下旋转蒸发形成一层均匀干燥薄膜，取下载薄膜的旋蒸瓶再进行冷冻干燥12 h尽量祛除残留的有机溶剂，吸取适量PBS促使薄膜水合，于40℃水浴下轻微振摇促进水化30 min，转入洁净西林瓶中超声20 min，促使粒子分散均匀，采用注射器吸取过0.22 μm微孔滤膜，除去沉淀物，再冷冻干燥24 h，即可获得川芎嗪 PEG-PLGA 纳米胶束［5］。

1.4.2 粒径、Zeta电位及形态吸取川芎嗪PEGPLGA纳米胶束溶液适量并稀释，以粒径仪测定Zeta电位分布和粒径；同样的办法采用移液枪吸取少量川芎嗪PEG-PLGA纳米胶束，滴加在铜网上，滤纸吸干溶液，室温烘干，采用JEM-2100 Plus透射电子显微镜观察纳米胶束的形态；另外，采用激光光束观察PEG-PLGA纳米胶束是否存在丁达尔现象。

1.4.3 包封率及载药量将上述制备的川芎嗪PEGPLGA纳米胶束置于超滤离心管（MW=3 000 Da）中，高速（10 000 r/min）冷冻离心5 min，离心管外为胶束外游离的川芎嗪，测定含量M游离，离心管内为载药纳米胶束，加入适量乙腈破坏纳米胶束，释放川芎嗪，采用HPLC检测包封的川芎嗪M包，即可计算纳米胶束的包封率（EE%），同时将离心管内的纳米胶束溶液冷冻干燥，然后称质量（M总重），即可计算载药量（DL%）。

EE%=M包÷（M包+M游离）×100%DL%=M包÷M总重×100%

M游离：离心后游离川芎嗪，M包：胶束中川芎嗪，M总重：川芎嗪PEG-PLGA纳米胶束质量

1.4.4 临界胶束浓度（criticalmicelle concentra⁃tion，CMC）测定 采用天平精密称取冻干PEGPLGA纳米胶束溶于适量，溶解于PBS溶液中，配制成1～12 μg/mL系列浓度PEG-PLGA纳米胶束溶液，然后与芘混合，25℃搅拌6 h，采用荧光光度仪检测芘的发射光谱I373和I394，根据各浓度下I394/I373比值，即可获得纳米胶束的 CMC［10］。

1.4.5 体外释放精密称取川芎嗪5 mg，采用适量PBS溶解，精密吸取适量体积含川芎嗪水溶液（含0.5 mg川芎嗪）置于Spectrumlabs透析袋（MW=3 000）中，同样的办法精密吸取适量川芎嗪PEGPLGA纳米胶束溶液（含0.5 mg川芎嗪），也装入透析袋中，封闭透析袋两端，再将两者置于PBS释放介质中，体积大约500 mL，pH值为7.4，调节温度保持在37℃水浴，以100 r/min转速研究胶束的体外释放行为。于设定时间点1、3、6、9、12、15、18、21、24、36、48、60 h取样，每次吸取1 mL进样检测，同时补充1 mL的PBS，采用HPLC检测每次取样中的川芎嗪浓度，计算累计释放率。

1.4.6 试验方法取70只SD大鼠，按体重分成两组，每组35只，然后将川芎嗪PEG-PLGA纳米胶束PBS溶解后，从大鼠的尾静脉注射给药，给药剂量按照各大鼠的体重进行调整，标准为20 mg/kg，注射给药5 min后，一组大鼠采用结扎冠脉的方式制备急性心肌缺血模型，另一组为正常大鼠，分别于注射给药后30、60、90、120、150、180、210 min这些时间点将大鼠处死5只，迅速解剖，取心、肝、脾、肺、肾、脑组织，按照体重选择部分组织，保存在-80℃的冰箱中，再按照“组织样品的处理”项下进行操作，进样分析后，测定两组心、肝、脾、肺、肾和脑中川芎嗪含量。

1.4.7 组织样品的制备取大鼠组织适量，按质量（g）与体积（mL）比为1：2加生理盐水，制成组织匀浆，精密吸取上层匀浆液300 μL，分别加入1 mL色谱甲醇和50 μL 6-甲基香豆素内标，涡旋混匀5 min，沉淀蛋白，高速离心（15 000 r/min）5 min祛除蛋白，取上清液800 μL，氮吹仪气流下吹干，然后再加入50 μL色谱甲醇溶解，高速离心（12 000 r/min）取上清液30 μL进样，测定组织样品中的药物浓度。

1.4.8 色谱条件菲罗门Luna-C18色谱柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），以甲醇和0.1%醋酸水为进行梯度洗脱。洗脱程序为：0～8 min，甲醇：10%～30%；8～10 min，甲醇：30% ～60%；10～12 min，甲醇：60% ～10%；12～13 min，甲醇：10%；柱温：30℃，检测波长：250 nm，流速：1.0 mL/min。

1.4.9 方法学考察及评价

1.4.9.1 专属性取大鼠空白肝组织、空白肝组织外加合适浓度的川芎嗪对照品和6-甲基香豆素内标配制的模拟组织样品、以及大鼠给药后采集的组织样品，按照“组织样品的制备”方法进行处理，采用上述HPLC条件进行测定，考察色谱条件方法的专属性。

1.4.9.2 标准溶液的配制精密称取川芎嗪对照品适量，加色谱甲醇溶解，配制成浓度为100 μg/mL的川芎嗪对照品储备液，再从中精密吸取100 μL，添加空白组织匀浆液 900 μL，形成10 μg/mL含药组织匀浆液，再进行稀释，可获得含川芎嗪的系列组织标准液，即为 5、2、1、0.5、0.25、0.13、0.06 μg/g样品，按照“组织样品的处理”进行操作，绘制各组织在系列浓度下的标准曲线。

1.4.9.3 精密度和准确度将川芎嗪与大鼠空白肝组织液混合，制成浓度为2、0.5、0.13 μg/g的质控（QC）样品，按照“组织样品的制备”进行处理，各浓度平行配制5份，连续配制3 d，进样分析，计算日内精密度和日间精密度，同时计算准确度。

1.4.9.4 稳定性考察取上述制备的3个浓度QC样品，考察样品冻融循环3次、-80℃下长期保存20 d、室温放置12 h下样品的含量、评估其稳定性。

2 结果

2.1 纳米胶束表征、载药量及包封率川芎嗪PEGPLGA纳米胶束大小为（15.8±0.9）nm，Zeta电势为（-20.5±0.4）mV，两者都呈良好的正态分布，表明纳米胶束制备良好。从TEM电镜显示川芎嗪PEGPLGA纳米胶束呈现规则的圆球性，粒径基本比较均一，少量微粒可能是电镜电压200 kV过高所致，导致形态大小出现了变化。另外，川芎嗪PEG-PLGA纳米胶束呈良好的丁达尔现象，说明胶束形成良好。经含量检测，川芎嗪PEG-PLGA纳米胶束的载药量为（4.8±0.5）%，包封率为（86.2±4.1）%，进一步说明纳米胶束包载川芎嗪良好，见图1。

图1 川芎嗪PEG-PLGA纳米胶束的粒径（a）、Zeta电位（b）、丁达尔现象（c）和透射电镜（d）Fig.1 Distribution of particle size（a），Zeta potential（b）and Tyndall phenomenon（c）TEM image of TMP-PEG-PLGA micelles（d）

2.2 临界胶束浓度的测定芘属于亲脂性芳香苯环内化合物，恰好可以包裹于PEG-PLGA纳米胶束亲脂性内核中，根据图2曲线的结果，胶束内核中的芘含量随着PEG-PLGA纳米胶束质量浓度增大，拐点处为PEG-PLGA纳米胶束的临界胶束浓度（CMC），该浓度下，芘恰好由游离态逐渐进入胶束内核，大约为4.1 μg/mL。

图2 PEG-PLGA纳米胶束的CMC Fig.2 CMC of PEG-PLGA micelles

2.3 体外释放川芎嗪在透析袋中呈突释状态，在24 h内已经释放92.8%，而川芎嗪PEG-PLGA纳米胶束先表现为较快释放状态，24 h后释药非常缓慢，由此推测PEG-PLGA纳米胶束可将川芎嗪紧密包裹在胶束内核，故川芎嗪在纳米胶束内基本呈现缓释状态。

图3 川芎嗪PEG-PLGA与川芎嗪体外释放曲线Fig.3 In vitro release profile fo TMP and TMP-PEG-PLGA micelles

2.4 方法专属性图4结果显示，组织样品中的内源性杂质均不影响TMP和6-甲基香豆素内标的分离测定，TMP与内标的保留时间分别为8.3和10.1 min左右，TMP与内标峰形良好，各峰均完全分离，表明方法专属性良好。

图4 川芎嗪色谱图Fig.4 HPLC Chromatograms of TMP：blank liver tissue（a）；blank liver tissue spiked with TMP（8.2 min）and 6-methylcoumarin（9.8 min）（b）；liver tissue sample after administraion of TMP-PEG-PLGA micelle（c）

2.5 标准曲线的建立川芎嗪在0.06～5 μg/g浓度范围内，表1结果显示各组织的药物浓度与峰面积呈良好的线性关系。

表1 组织样品中川芎嗪的标准曲线Tab.1 Standard curves of TMP in difference tissue sample

2.6 精密度和准确度日内精密度及日间精密度分别在6.8%、8.4%以内，准确度也基本落在87.7%～104.5%范围之内。该结果表明，该方法的精密度和准确度均比较好。

2.7 稳定性TMP在上述3种条件下贮存后，浓度变化小，偏差不超过10%，说明TMP组织样品在所考察的条件下能稳定存在。

2.8 组织分布如图5所示，川芎嗪PEG-PLGA纳米胶束在主要脏器均有分布，脑内分布相对较少，采用DAS 3.0软件计算生物利用度，结果见表2，载药纳米胶束在正常大鼠各组织中AUC分布大小顺序为肺＞肝＞脾＞心≈肾＞脑，但是，川芎嗪PEGPLGA纳米胶束在急性心肌缺血模型大鼠各组织中AUC分布大小顺序为肺＞肝＞心＞脾＞肾＞脑，川芎嗪PEG-PLGA纳米胶束在急性心肌缺血模型大鼠心脏AUC为正常大鼠心脏的1.68倍，具有显著性差异（P＜0.05），由此表明，川芎嗪PEG-PLGA纳米胶束可以将药物靶向聚集在缺血心肌部位。

图5 川芎嗪PEG-PLGA纳米胶束在正常大鼠（a）与急性心肌缺血模型大鼠（b）中的组织分布Tab.5 Tissue distribution profiles of TMP-loaded PEG-PLGA micelles in normal rats（a）and acute myocardial ischemia model rats（b）

表2 川芎嗪PEG-PLGA纳米胶束在在正常大鼠与急性心肌缺血模型大鼠组织中的AUC分布Tab.2 AUC of tissue distribution profile of TMP-load PEGPLGA micelles in normal rats and acute myocardial ischemia model rats x±s

注：与正常大鼠比较，*P＜0.05

组织样本心肝脾肺肾脑急性心肌缺血模型大鼠5.33±0.22*5.89±0.27 3.75±0.23 7.62±0.31 2.85±0.48 0.16±0.08 AUC0→∞（μg/g·min）正常大鼠3.17±0.35 6.08±0.47 4.68±0.55 8.26±0.42 3.03±0.25 0.21±0.18

3 讨论

PEG-PLGA是由聚乙二醇-聚乳酸/羟基乙酸共聚物组成的两亲性嵌段聚合物，核心成分为PLGA，聚乳酸具有亲脂性、降解较慢；外周PEG则亲水性较好、体内可以长循环，缓慢释放药物，故可以使那些水难溶性药物高效地进入机体组织。另外，PLGA经过PEG修饰后，由于PEG具有良好的生物相容性和无免疫原性，可避免网状内皮系统（RES）的清除，进一步延长药物在体内的循环时间［11］。从本研究结果分析，川芎嗪PEG-PLGA纳米胶束粒径大小为（15.8±0.9）nm，Zeta电势为-（20.5±0.4）mV，基本上呈对称性良好的正态分布，TEM电镜直观表明，川芎嗪PEG-PLGA纳米胶束为形态规格的圆球型，由此推测，川芎嗪被牢固包藏在PEG-PLGA纳米胶束内核中，PLGA能与亲脂性的川芎嗪很好的融合在一起，故能形成粒径大小比较均一的纳米胶束［12］。丁达尔现象也证实，PEGPLGA形成了微粒较小的纳米胶束，故可对光进行散射，形成了色彩清晰明亮的光束。体外释放试验证实，川芎嗪PEG-PLGA纳米胶束呈现缓慢释放的状态。

心肌缺血时会血管内膜通透性异常升高，缺血部位的血管壁之间存在间隙，PEG-PLGA高分子在缺血心肌部位具有良好的EPR效应［13-15］。凭借该效应，PEG-PLGA纳米胶束在心肌缺血区域间隙增大的血管内壁自由出入，渗透到缺血心肌部位，加之炎症部位的血流相对缓慢，外周PEG属于长链状高分子，可缠绕在缺血心肌细胞周围，进一步加强药物载体的滞留作用。本研究结果发现，川芎嗪PEG-PLGA纳米胶束在急性心肌缺血模型大鼠心脏中AUC为正常大鼠心脏中的1.68倍。所以，笔者得出PEG-PLGA纳米胶束可将药物蓄积于缺血心肌部位，有助于提高药物在病变部位的药理作用的结论。