苏兰娣 李芹 江秀玲 罗雪 彭建明

扬州市职业大学医学院（江苏扬州225009）

肠癌是恶性肿瘤中常见的死亡原因之一。根据美国肿瘤协会的统计，在2016年美国大约有140万的肠癌患者，此外还有134 490例新发的肠癌患者［1］。因此，肠癌已经成为急需解决的全球健康问题之一。现有研究发现，肠癌主要由肿瘤干细胞所起始，肿瘤干细胞是实体瘤中一小群的肿瘤细胞，这些肿瘤细胞能够驱动恶性肿瘤的发生、发展和转移［2-4］。肿瘤干细胞最初在急性髓细胞白血病中被发现，随后在其他多种类型的肿瘤如乳腺癌、肠癌、肺癌等亦存在肿瘤干细胞。虽然肿瘤干细胞在肠癌细胞中的比例不高，但肿瘤干细胞却是促使肠癌恶性进展、转移、复发和耐药的罪魁祸首［2，4］。因此，靶向肠癌干细胞已成为抗肠癌药物研发中的热点。

雷公藤红素（Celastrol）是一种五环三萜类化合物，主要来源于雷公藤、南蛇藤等植物。研究显示，雷公藤红素具有抗炎、抗生育、抗菌以及抗肿瘤等多种药理学功能［5-6］。然而关于雷公藤红素对肠癌细胞干性的作用甚少见于报道。本研究以人肠癌细胞CCL-244为模型，分析了雷公藤红素对肠癌细胞干性的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株及培养人肠癌细胞CCL-244购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。CCL-244细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，放于37℃、5%CO2细胞培养箱中进行培养。以下各实验部分所用细胞均为对数生长期的细胞。

1.2 主要试剂与仪器雷公藤红素购自上海诗丹德生物公司，纯度＞98%，用二甲基亚砜（DMSO）配置成50 mmol/L备用；胎牛血清和DMEM培养基均为美国Gibco公司产品；四甲基偶氮唑盐（MTT）购自AMRESO公司；Trizol、逆转录试剂盒、PCR试剂盒和通用二抗购于北京全式金生物公司；PCR引物购自上海生物工程技术有限公司；CD133、CD44、pAKT和AKT和GAPDH一抗购于美国Cell Signaling Technology公司。EPS 300电泳仪购自上海天能科技有限公司，二氧化碳细胞培养箱购于美国Thermo Forma公司，半干转系统购自美国BIORAD公司。

1.3 MTT法测定细胞体外生长取对数生长期的细胞，将细胞浓度调整为5×104个/mL，以每孔100 μL接种于96孔板中。加入不同浓度的雷公藤红素48 h后，利用MTT法测定肿瘤细胞的活性。每孔加入10 μL MTT混匀后在37℃培养4 h。然后吸弃上清，每孔加入100 μL DMSO，利用酶标仪测定OD492 nm的吸光度值。抑制率计算如下：抑制率=（1-OD药物组/OD对照组）×100%。

1.4 细胞克隆形成测定CCL-244细胞经消化后以500/孔接种于6孔板中，第2天分别给药雷公藤红素至终浓度分别为0、1、2 μmol/L。以后每隔3～4 d替换培养基一次，培养14 d后终止实验，使用甲醇进行固定，然后进行吉姆萨染色，在显微镜下计数各个孔克隆的数量。

1.5 RT⁃PCR法检测基因的表达细胞经雷公藤红素处理后，用TRIzol法提取总RNA，逆转录为第一链互补DNA（cDNA）。然后以cDNA为模板，采用PCR法测定细胞内CD133、CD44和Oct4基因的表达情况。内参基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。引物如下：CD133上游引物为5′-AGGCACTTACGGCACTCTTC-3′，下游引物为 5′-GAAGGACTCGTTGCTGGTGA-3′；CD44 上游引物为 5′-CAGCTCATACCAGCCATCCA-3′，下游引物为 5′-AGGTCCTGCTTTCCTTCGTG-3′；Oct4上游引物为5′-GCAAAGCAGAAACCCTCGTG-3′，下游引物为5′-AGCCTGGGGTACCAAAATGG-3′；GAPDH 上游引物为 5′-GAGAAGGCTGGGGCTCATTT-3′，下游引物为5′-AGTGATGGCATGGACTGTGG-3′。

1.6 Westernblot法检测蛋白的表达 细胞经雷公藤红素处理后，收集细胞并提取细胞总蛋白，BCA法进行蛋白定量。按照文献报道方法进行配胶后电泳，然后转膜2 h后用5%牛奶封闭，一抗室温孵育2 h后，经洗涤后用二抗孵育1 h后进行曝光并显影。采用Western blot ImageJ对蛋白条带进行半定量分析。

1.7 统计学方法所有数据均以平均值±标准差表示，采用SPSSOne-way ANOVA检验12.0统计软件进行统计学处理，组间分析采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 雷公藤红素抗肿瘤细胞增殖利用MTT法测定不同剂量的雷公藤红素对肠癌细胞CCL-244增殖的影响。结果显示，雷公藤红素对肠癌细胞CCL-244的生长具有显著的抑制效果，雷公藤红素各剂量组与对照组（只有培养液）相比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），而且随药物剂量的不断增加，其抑制效果亦更加显著（表1），提示雷公藤红素能显著地抑制肠癌细胞CCL-244增殖。

表1 雷公藤红素对肠癌细胞CCL-244增殖的影响Tab.1 Effects of celastrol on the proliferation of CCL-244 cells x±s

表1 雷公藤红素对肠癌细胞CCL-244增殖的影响Tab.1 Effects of celastrol on the proliferation of CCL-244 cells x±s

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别增殖率（%）对照组100 0.25 μmol/L 93.7±1.5 0.5 μmol/L 79.5±1.1*1 μmol/L 66.8±0.1**2 μmol/L 43.5±0.4**4 μmol/L 14.7±0.0**8 μmol/L 11.0±1.0**

2.2 雷公藤红素对肠癌细胞CCL⁃244克隆形成的影响用平板克隆形成实验对雷公藤红素抗肠癌的作用进行了研究，结果如表2所示，1和2 μmol/L雷公藤红素处理肠癌细胞CCL-244后其克隆形成数量分别为（166.3±5.5）和（109.7±11.0），与对照组（215.00±8.9）比较，差异具有统计学意义（P＜0.01），表明雷公藤红素能够明显地抑制肠癌细胞CCL-244的克隆形成。

2.3 雷公藤红素对肠癌细胞CCL⁃244干性相关基因表达的作用雷公藤红素处理48 h后，RT-PCR法测定干性相关基因的表达，结果如图1所示，与对照组比较，雷公藤红素组细胞内的细胞干性相关的基因 CD133（P＜ 0.01）、CD44（P＜ 0.01）和Oct4（P＜0.01）mRNA水平显著下降。

表2 雷公藤红素处理后对CCL-244细胞克隆形成的影响Tab.2 Effects of celastrol on the colony formation of CCL-244 cells x±s

表2 雷公藤红素处理后对CCL-244细胞克隆形成的影响Tab.2 Effects of celastrol on the colony formation of CCL-244 cells x±s

注：与对照组比较，**P＜0.01

组别对照组1 μmol/L 2 μmol/L克隆数量215.00±8.89 166.33±5.51**109.67±10.97**

图1 雷公藤红素处理后对CCL-244细胞基因表达的作用Fig.1 Effects of celastrol on the expression of genes in CCL-244 cells

2.4 雷公藤红素对肠癌细胞CCL⁃244干性相关蛋白表达的作用结果如图2所示，与对照组比较，雷公藤红素组细胞内的干性相关的蛋白CD133（P＜0.01）和CD44（P＜ 0.01）均呈现明显下降趋势。

2.5 雷公藤红素对肠癌细胞CCL⁃244信号通路的作用结果如图3所示，雷公藤红素作用后pAKT的表达水平显著下降（P＜0.05），而对AKT的表达则没有明显影响。

图2 雷公藤红素处理后对CCL-244细胞蛋白表达的影响Fig.2 Effects of celastrol on the expression of proteins in CCL-244 cells

图3 雷公藤红素处理后对CCL-244细胞信号通路蛋白表达的影响Fig.3 Effects of celastrol on the expression of signaling pathways in CCL-244 cells

3 讨论

肠癌已成为恶性肿瘤死亡的第二大因素，5-氟尿嘧啶（5-FU）迄今仍然是临床上治疗肠癌的一线药物［7］。然而5-FU单药治疗的临床响应率仅为15%左右，因此一般5-FU与其他临床抗癌药物合用以增加治疗效果，如5-FU与伊立替康或者奥利沙铂联合使用可以使临床响应率提高到40%左右［8］。最新研究结果显示，5-FU与bevacizumab和cetuximab联合使用可以使对肠癌的响应率达到60%～70%。但是对化疗药物的耐药性仍然是提高肠癌患者生存时间的主要原因［9］。此外，5-FU与化疗药物联合使用常常产生比较严重的副作用。因此，高效的抗肠癌药物迄今为止仍然存在很大的缺口。中草药是抗癌药物分子的重要来源，从中草药中也发现了很多重要的抗癌药物，如紫杉醇等。雷公藤红素是来源于中药雷公藤属植物的单体成分，具有多种生物学功能，包括抗菌、抗生育、抗炎和抗癌等［10-11］。目前关于雷公藤红素抗肠癌机制的报道主要是抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡等［10-11］，而对雷公藤红素对肠癌细胞干性的影响鲜有研究。

近年来研究表明，肠癌中存在肿瘤干细胞，即肠癌干细胞［3，9］。两项独立的研究结果显示，肠癌组织中存在一群CD133+致瘤能力强、自我更新快的肿瘤细胞，而CD133-的肠癌细胞曾无法形成肿瘤［3-4，12］。此外，CD133+细胞在体外能够在不分化状态下维持培养达1年以上［11］。因此，CD133是肠癌细胞重要的“干性”标记物。近年来，越来越多的研究结果显示，这一小群肠癌细胞除了表达CD133外，还表达其他几种“干性”标记物，如CD44、Oct4、ALDH1 等［11，13-14］。在本研究中，以肠癌细胞CCL-244为细胞模型，对雷公藤红素抑制肠癌细胞干性进行了研究。本研究结果表明，雷公藤红素体外能够抑制肠癌CCL-244细胞的生长，并且抑制细胞的克隆形成。机制研究结果显示，雷公藤红素能够抑制肠癌细胞干性标记物CD133、CD44和Oct4基因的表达，降低肠癌细胞CD133和CD44蛋白的表达，表明雷公藤红素对肠癌细胞的干性维持具有很好的抑制作用。

AKT信号通路不仅参与多种重要的细胞生理过程如细胞增殖、迁移、侵袭、分化、凋亡、血管生成等，还参与恶性肿瘤细胞的干性维持［15-16］。所以笔者还探讨了雷公藤红素是否对AKT信号通路有作用。本研究结果显示，雷公藤红素能够明显地抑制AKT的磷酸化水平，而对AKT的水平没有影响，表明雷公藤红素可能通过抑制AKT信号通路来抑制肠癌细胞的干性。

综上所述，本研究结果表明，雷公藤红素可抑制人肠癌CCL-244细胞增殖和克隆形成，这可能与抑制干性相关基因和蛋白CD133、CD44等的表达、抑制AKT信号通路有关。