何紫薇 张玉林 吴 杰 杜娟娟 杨建发 杨国琴

(1.云南农业大学动物医学院，云南省高校兽医公共卫生重点实验室，昆明，650201；2.中国科学院昆明动物研究所，昆明，650201；3.滇西科技师范学院，临沧，677000)

疟疾(Malaria)是由疟原虫(Plasmodiumspp.)经按蚊传播引起的一种世界性分布、对人危害极为严重的人兽共患寄生虫病，已成为全球广泛关注的重要公共卫生问题之一。疟原虫种类较多，已知约150种，主要寄生于人和哺乳动物，少数寄生于鸟类和爬行动物[1]。寄生于人体的疟原虫主要有4种，即恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、间日疟原虫(Plasmodiumvivax)、卵形疟原虫(Plasmodiumovale)和三日疟原虫(Plasmodiummalariae)，它们分别导致恶性疟疾、间日疟疾、卵形疟疾和三日疟疾[2]。在4种疟疾寄生虫中，间日疟原虫的地理分布最为广泛，在亚洲、中美洲和南美洲、中东、大洋洲和东非都有间日疟流行[3-4]。2015年全球间日疟病例约138万例，占全球疟疾病例总数的25%—40%[5]，间日疟原虫是第二大疟疾流行物种，因此间日疟原虫很可能成为疟疾的主要威胁[6]。

云南由于特殊的地域和气候特点，成为了我国疟疾流行地区之一。有调查表明，云南间日疟原虫IgG抗体血清流行病学调查结果中女性为9.98%，男性为10.79%[7]。

猴通常作为人类疾病的模型动物，关于非人类灵长类实验动物间日疟原虫感染情况的流行病学调查在云南地区尚未报道[8-9]。本调查对象主要包括恒河猴(Macacamulatta)、豚尾猴(Macacanemestrina)和食蟹猴(Macacafascicularis)3种实验猴。通过采集猴血液为样本进行ELISA检测，初步了解该研究中心实验猴间日疟原虫感染情况，为猕猴属动物或其他非人类灵长类实验动物间日疟原虫病的防治提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

恒河猴、豚尾猴、食蟹猴3种实验猕猴血清均于2017年11月至2018年5月采自云南省昆明市某灵长类研究中心(216只单笼饲养，277只群体饲养)。

1.1.2 主要试剂

猴间日疟原虫(PLV)ELISA试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司(MLBIO Biotechnology Co.，Ltd，Shanghai，China)，阳性对照和阴性对照均来自于该试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 样品采集

采用静脉采血的方法，每管采集3—4 mL前肢静脉血至肝素纳抗凝采血管，反复颠倒混匀，4℃保存。在实验室内，将采集到的血液血清分离，3 000 r/min离心5 min，分别得到的有效血清样品有恒河猴血清319份，豚尾猴血清89份，食蟹猴血清85份，共获得493份血清样品。

1.2.2 间日疟原虫酶联免疫分析

参照猴间日疟原虫(PLV)ELISA试剂盒说明书，应用双抗体夹心法检测猴血清样本中的间日疟原虫抗原。计算和结果判定：只有当阳性对照孔平均值≥1.00，阴性对照平均值≤0.10时为有效试验，才可对待测血清结果进行判定。临界值(CUT OFF)计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15。判定待检测血清样品，OD值<临界值为间日疟原虫阴性，OD≥值临界值为间日疟原虫阳性。

1.2.3 统计学分析

采用SPSS 20.0软件分析数据。采用χ2检验分析猕猴不同品种，性别和年龄间在间日疟原虫感染情况上的差异，并对猕猴感染间日疟原虫风险因素进行分析。

2 结果与分析

2.1 3种猕猴感染间日疟原虫的血清阳性率

本次调查样品均来自云南昆明某灵长类研究中心，共检测有效猕猴血清样本493份。其中，恒河猴319份，ELISA检测为阳性的有3份，血清阳性率为0.94%；豚尾猴89份，ELISA检测为阳性的有5份，血清阳性率为5.62%；食蟹猴85份，检出率最低为0%，统计3种猕猴间日疟原虫血清阳性率平均为1.62%(表1)。

表1 不同品种的实验猴间日疟原虫感染的血清阳性率

Tab.1 Seroprevalence of Plasmodium vivax in different species of experimental monkeys

2.2 不同性别的实验猴间日疟原虫感染的血清阳性率

从性别上分析，493份猴血清样本中包括公猴样本173份，母猴样本320份。ELISA检测结果显示公猴感染间日疟原虫阳性样本有5份，母猴感染间日疟原虫阳性样本有3份，公猴和母猴的血清阳性率分别为2.89%和0.94%(表2)。

表2 不同性别的实验猴间日疟原虫感染的血清阳性率

Tab.2 Seroprevalence of Plasmodium vivax in different sexes of experimental monkeys

2.3 不同年龄的实验猴间日疟原虫感染的血清阳性率

从年龄上分析，493份血清样本中包括了1—24岁不同年龄段的实验猴，其中青年猴(≤4岁)样本有261份，成年猴(>4岁)样本有232份。ELISA检测结果显示，青年猴感染间日疟原虫阳性样本有8份，血清阳性率为3.07%，而在成年猴里没有发现间日疟原虫感染(表3)。

表3 不同年龄的实验猴间日疟原虫感染的血清阳性率

Tab.3 Seroprevalence of Plasmodium vivax in different ages of experimental monkeys

2.4 不同品种、性别和年龄的实验猴感染间日疟原虫的差异分析

应用SPSS 20.0软件进行数据分析，采用卡方检验分析不同品种，性别和年龄的实验猴在间日疟原虫感染情况上的差异。结果表明，不同品种的实验猴感染间日疟原虫的血清阳性率不同，存在显著差异(χ2=11.213，P<0.05)；不同性别的实验猴感染间日疟原虫的血清阳性率不存在显著差异(χ2=2.682，P>0.05)；而不同年龄的实验猴感染间日疟原虫的血清阳性率不同，存在显著差异(χ2=7.228，P<0.05)(表4)。

表4 实验猴不同品种、性别和年龄感染间日疟原虫χ2检验结果

Tab.4 Results of χ2 test of Plasmodium vivax in different varieties，sexes and ages of experimental monkeys

2.5 实验猴间日疟原虫感染风险分析

本实验对云南昆明某灵长类研究中心实验猴间日疟原虫感染风险因素进行了多元逻辑回归分析，将是否感染间日疟原虫作为因变量，品种、性别、年龄3个因素作为自变量，但由上述卡方检验结果(表4)已得出，实验猴的性别差异不显著(P>0.05)，不必进行逻辑回归分析。简单从血清阳性率来看，青年猴(3.07%)感染间日疟原虫的风险要明显大于成年猴(0%)；从回归分析结果来看，品种因素是引起实验猴感染间日疟原虫的主要风险因子(P=0.004<0.05)。以恒河猴为参考，豚尾猴(OR=6.270，95%CI=1.469-26.770，P=0.047<0.05)更易感染间日疟原虫病。而食蟹猴感染间日疟原虫的风险要低于恒河猴(P=0.084>0.05)(表5)。

表5 实验猴间日疟原虫感染风险多元逻辑回归分析结果

Tab.5 Results of logistics regression analysis of the risk of infection of Plasmodium vivax in experimental monkeys

3 讨论

3.1 不同品种和年龄的实验猴间日疟原虫感染差异性原因分析

猕猴属(Macaca)动物作为医学生物学研究领域中日益广泛使用的实验动物，寄生虫的感染不仅影响动物的饲养繁殖以及实验动物标准工作，而且直接关系到科学实验结果的准确获得[10]，此外，间日疟原虫为人猴共患寄生虫。虽然人和动物的疟原虫一般不发生交叉感染，即人的疟原虫不感染动物，动物的疟原虫也不感染人。但在实验室内偶有例外，曾出现寄生于猴、黑猩猩(Pantroglodytes)的疟原虫感染人，三日疟原虫感染黑猩猩和夜猴(Aotustrivirgatus)[11]。因此对实验猴感染间日疟原虫的血清学调查对相关的工作员和实验动物来说都具有十分重要的公共卫生意义。

本次血清学调查结果发现，493份实验猴血清样本中判定出有8份为间日疟原虫抗原阳性，血清阳性率约为1.62%，造成感染的原因跟实验猴的来源和饲养环境有很大的关系。据了解，该灵长类研究中心饲养的猴大部分都是自繁殖而来，每年投喂2次伊维菌素，实验猴的饲养环境主要是平房式猴舍(三面墙一面铁栏朝外)，通风条件较好。猴舍周围是大片草坪和绿植，背面靠山，环境优美，但由于饲养环境地处于山林周围，并且紧挨着一条排水沟，一到秋夏季节蚊虫较多的时候，便为其提供了一个较好的滋生环境。猴舍四周也没有专用的防蚊装置，因此就增加了携带有间日疟原虫的蚊虫传播病原的机会。

不同品种和年龄的实验猴感染间日疟原虫的血清阳性率存在显著差异。其中豚尾猴的血清阳性率最高，食蟹猴中则无间日疟原虫感染。青年猴的血清阳性率也明显高于成年猴。这种差异的出现可能与不同品种实验猴的生活习性不同或是体质差异有关，也可能随着年龄的增长，成年猴自身免疫力相对较强，对间日疟原虫的抵抗力也逐渐增强，相对于4岁及以下的幼年和青年猴，成年猴感染间日疟原虫的风险更低。从饲养管理的角度来看，分为单笼饲养和群体饲养两种方式，不难发现在这8只感染间日疟原虫的阳性猴中，有6只都是单笼饲养，其余2只群体饲养，日常饲料都是以自制蒸糕为主。由于单笼饲养的猴活动范围受限，静止状态时更容易招引蚊虫的叮咬，而群养的猴活动范围比较宽阔，整体也更为活跃，不太容易吸引蚊虫。由此我们可以怀疑，差异的出现也可能是由于饲养管理的不同所导致。

感染间日疟原虫的8只猴并没有表现出明显的间日疟疾临床症状，间日疟原虫在人和动物体内的存活时间通常为2年，部分可长达5年[12]。而猴在感染疟原虫后，通常要经过一段时间才表现出临床症状[13]，这8只猴很有可能是轻度感染者，可成为带虫者而无明显的临床症状，同时也是潜在的内部感染源[14]，应引起饲养人员的重视，重点观察这8只猴的日常精神状态，并与其他猴隔离饲养。

3.2 当前感染风险分析及防治建议

由间日疟原虫感染引起的疾病问题往往容易被人忽视，曾有调查显示，这种寄生虫每年导致大约1亿—3亿个临床病例[15]。在非洲以外，间日疟原虫占所有疟疾病例的50%，由于间日疟原虫流行的大多数地区疟疾传播率较低，受影响的人群对该寄生虫的免疫力很弱[16]，该问题在实验猴身上同样也不可忽视。对于日常饲养管理实验猴的工作人员来说，并不是没有感染的可能。带虫的猴都会成为潜在的内部感染源，叮咬了带虫猴的蚊子再次叮咬人后，便会把子孢子顺理成章地注入到人体内，入侵肝脏细胞，对人体健康造成危害。早期国内就有研究者采用薄片法，取猴外周血制成血膜薄片，用吉姆萨染色并在高倍镜下观察到猴疟原虫感染。血片中常见裂殖体和配子体时期，多见于我国豚尾猴中，恒河猴中亦有发现[17-18]。猴感染疟原虫后会出现厌食，反应迟钝，体质消瘦，面色苍白，有时还伴有猴血尿[19]。对此我们应引起重视，并提醒从事实验动物繁育工作或是动物园的饲养人员，制定一套科学健康的饲养管理方案，加强间日疟原虫的防治工作。可在猴舍安装纱门、纱窗等，以减少蚊子对实验猴的叮咬，并适时安排驱虫，提高实验猴质量。工作人员自身也要做好相应的防蚊工作，比如使用蚊帐、点驱蚊药片或蚊香，在身体外露部分涂抹驱蚊膏。最后做好综合防制，保持猴舍和人员居住区周围环境的干净整洁，疏通积水，在下水道经常喷杀虫药，以消灭蚊虫滋生环境。