马晓莉，叶 齐，宁书菊，蔡国倩，公培民，魏道智*

(1.福建农林大学食品科学学院，福建省农业生态过程与安全监控中重点实验室，福建福州 350002；2.福建农林大学生命科学学院，福建省农业生态过程与安全监控中重点实验室，福建福州 350002；3.福建农林大学作物学院，作物生态与分子生理学福建省高校重点实验室，福建福州 350002)

锈毛莓(RubusreflexusKer.)为蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus)药用植物，其根茎均能入药。锈毛莓含有多种有效的化学成分，具有多种药理活性和较高的药用价值，福建闽南客家和畲族民间多用锈毛莓根、茎煲汤做茶饮，治疗肝火虚妄、目赤肿痛，以宣泄肝火，被誉为保肝护肝良药[1]。萜类是悬钩子属植物中含量较高的成分，从悬钩子属植物中分离到的萜类化合物主要是二萜、三萜以及少数单萜，其中三萜类占多数[2-4]。目前对锈毛莓总三萜的研究甚少，实验室已通过液相方法确定锈毛莓醇提物中含有熊果酸和齐墩果酸，在前期预试验中发现锈毛莓总三萜对肝损伤小鼠有一定的修护作用，为提高锈毛莓总三萜的利用率，该试验优化总三萜提取工艺，并确定其抗氧化活性，以期为后期锈毛莓三萜类成分的研究奠定试验基础。

1 材料与方法

1.1材料与试剂锈毛莓干燥根茎购自福建龙岩(由福建农林大学魏道智教授鉴定)；熊果酸标准品(上海麦克林生化科技有限公司)；1，1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH)、2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)均购于北京索莱宝科技有限公司；香草醛、冰醋酸、高氯酸、乙醇、水杨酸、双氧水(H2O2)、七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、过二硫酸钾(K2S2O8)均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器FA2004电子分析天平，上海上平仪器公司；5804R离心机，艾本德有限公司；超纯水机，四川沃特尔科技发展有限公司；HH-6数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限公司；RE-2000B旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；DLSB低温冷却循环系统，郑州长城科工贸有限公司；101-1AB电热鼓风干燥器，天津市泰斯特仪器有限公司；FW-80高速万能粉碎机，上海新诺仪器设备有限公司。

1.3试验方法

1.3.1标准曲线的绘制。精密称取熊果酸标准品12.3 mg，加无水乙醇定容至25 mL，制成0.492 mg/mL的标准溶液，分别吸取0、25、50、100、200、300、400、500和600 μL于比色管中，将比色管置于水浴锅挥干，冷却至室温。加200 μL的5%香草醛-冰醋酸和800 μL高氯酸，摇匀，于70 ℃水浴15 min，冰水冷却至室温，加5 mL冰醋酸，摇匀，于546 nm处测吸光度，以熊果酸质量(μg)为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线[5-6]，得到回归方程Y=0.004 6X+0.042 3，R2=0.999 2，对照品含量在0～295.2 μg呈良好的线性关系。

1.3.2锈毛莓总三萜提取工艺及其含量测定。将锈毛莓根茎于60 ℃烘干，粉碎过60目筛，准确称取锈毛莓粉末2.0 g，按照设定的不同条件进行超声提取，乙醇补足失重，抽滤得滤液。参照“1.3.1”方法于546 nm处测吸光度，代入回归方程，计算锈毛莓总三萜的含量及提取率。

总三萜提取率=(m×V)/(M×v)×100%

(1)

式中，m为代入回归方程计算所得总三萜质量；M为锈毛莓粉末质量；v为参加反应加入的提取液体积；V为提取液总体积。

1.3.3单因素试验。采用超声提取锈毛莓总三萜，选择乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声功率、超声温度进行单因素试验，分别考察它们对锈毛莓总三萜提取率的影响。

1.3.4响应面优化设计。通过单因素试验分析，根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，以料液比、超声时间、超声功率、乙醇体积分数为因素进行组合设计，并用响应面分析方法优化锈毛莓总三萜的提取条件。

1.3.5锈毛莓总三萜抗氧化活性研究。

1.3.5.1锈毛莓总三萜对·OH清除能力的测定。在比色管中依次加入等体积(1 mL)不同浓度的锈毛莓总三萜溶液、9 mmol/L的FeSO4·7H2O溶液、9 mmol/L的水杨酸乙醇溶液、8.8 mmol/L的H2O2溶液、6 mL去离子水，摇匀，37 ℃水浴30 min，于510 nm测吸光度[7-8]，以等量75%乙醇代替样品做空白对照组，以VC做阳性对照，每组平行测定3次，按式(2)计算清除率。

清除率=(A0-Ai)/A0×100%

(2)

式中，A0为空白对照组的吸光度，Ai为样品或阳性对照溶液吸光度。

1.3.5.2锈毛莓总三萜对DPPH·清除能力的测定。用无水乙醇配制0.2 mmol/L的DPPH溶液，取2 mL DPPH溶液，以少量多次的方式加入锈毛莓总三萜溶液，边加边混匀，观察DPPH溶液的褪色情况，记录加入药量，配制适宜浓度的锈毛莓总三萜溶液。

在比色管中依次加入不同质量浓度(0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.16和0.20 mg/mL)的锈毛莓总三萜溶液1 mL、0.2 mmol/L的DPPH溶液2 mL，旋涡混匀，避光反应30 min后517 nm波长处测吸光度[9]。以等量75%乙醇代替样品做空白对照组，以VC做阳性对照，每组平行测定3次，按式(3)计算清除率。

清除率=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%

(3)

式中,A0为空白对照组的吸光度；Ai为样品或阳性对照溶液吸光度；Aj为无水乙醇溶液代替DPPH溶液的吸光度。

1.3.5.3锈毛莓总三萜对ABTS+·清除能力的测定。取等量7.4 mmol/L的ABTS溶液和2.6 mmol/L的K2S2O8溶液旋涡混匀，在室温下避光反应16 h，用无水乙醇稀释，直至其吸光度在波长734 nm处为0.70±0.02，即为ABTS+·工作液。

在比色管中依次加入3.2 mL ABTS+·工作液和0.8 mL不同质量浓度(0、0.001 25、0.002 50、0.006 25、0.012 50、0.018 75、0.025 00、0.031 25、0.037 50和0.050 00 mg/mL)的总三萜溶液，旋涡混匀，避光反应6 min，在734 nm波长处测吸光度[10-11]。以等量75%乙醇代替样品做空白对照组，VC做阳性对照，每组平行测定3次，按式(4)计算清除率。

清除率=(A0-Ai)/A0×100%

(4)

式中，A0为空白对照组的吸光度，Ai为样品或阳性对照溶液吸光度。

2 结果与分析

2.1锈毛莓总三萜单因素试验

2.1.1乙醇体积分数对总三萜提取率的影响。精确称取15份锈毛莓粉末，按料液比1∶20(g∶mL)加入不同体积分数的乙醇溶液(55%、65%、75%、85%和95%)，每组3个平行，超声功率350 W，超声温度60 ℃，超声提取30 min，补足失重，抽滤测总三萜含量。结果如图1所示，总三萜提取率随乙醇溶液体积分数的增加先增后减，当乙醇体积分数为75%时达到最大值。

图1 乙醇体积分数对锈毛莓总三萜提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of total triterpenes from Rubus reflexus

2.1.2料液比对总三萜提取率的影响。精确称取15份锈毛莓粉末，按不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50)加入95%的乙醇溶液，每组3个平行，超声功率350 W，超声温度60 ℃，超声提取30 min，补足失重，抽滤测总三萜含量。结果如图2所示，总三萜提取率随料液比的增加先增后减，在一定范围内增加料液比，有利于三萜类成分析出，当料液比达1∶30时，提取率达到最大值。

图2 料液比对锈毛莓总三萜提取率的影响Fig.2 Effect of materia-liquid ratio on extraction rate of total triterpenes from Rubus reflexus

2.1.3超声时间对总三萜提取率的影响。精确称取18份锈毛莓粉末，按料液比1∶20加入95%的乙醇溶液，超声功率350 W，超声温度60 ℃，分别超声提取15、30、45、60、75和90 min，每组3个平行，补足失重，抽滤测总三萜含量。结果如图3所示，在60 min内，锈毛莓总三萜提取率随提取时间的增加而增加，且增加幅度不断增大。60 min以后，提取率随超声时间的增加而减少，可能是提取时间过长，使其他成分析出，抑制了三萜类成分的提取。

图3 超声时间对锈毛莓总三萜提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of total triterpenes from Rubus reflexus

2.1.4超声功率对总三萜提取率的影响。精确称取21份锈毛莓粉末，按料液比1∶20加入95%的乙醇溶液，超声温度60 ℃，采用不同超声功率(200、250、300、350、400、450和500 W)，每组3个平行，超声提取15 min，补足失重，抽滤测总三萜含量。结果如图4所示，锈毛莓总三萜提取率随超声功率的增大先增后减。功率过大，可能会破坏三萜类成分，或有益于其他成分析出，从而抑制三萜类成分的提取，故选取提取功率为400 W。

图4 超声功率对锈毛莓总三萜提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction rate of total triterpenes from Rubus reflexus

2.1.5超声提取温度对总三萜提取率的影响。精确称取18份锈毛莓粉末，按料液比1∶20加入95%的乙醇溶液，超声功率350 W，采用不同的超声温度(30、40、50、60、70和80 ℃)，每组3个平行，超声提取15 min，补足失重，抽滤测总三萜含量。结果如图5所示，在30～80 ℃，锈毛莓总三萜提取率随温度的升高而增加，故选择实验室超声所能达到的最高温度80 ℃进行后续试验。

图5 超声提取温度对锈毛莓总三萜提取率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic extraction temperature on extraction rate of total triterpenes from Rubus reflexus

表1 因素与水平

表2 试验设计及结果

利用Design-Expert 8.06对各因素之间的交互作用做出相应的响应面图和等高线图。响应面图坡度越陡，说明该因素对总三萜的提取率影响越大；等高线图圆形说明2个因素交互作用不显著，椭圆说明2个因素交互作用显著[14]。如图6所示，在交互项对总三萜提取率的影响中，超声时间与乙醇体积分数的交互作用显著，其他不显著，与方差分析结果一致。

图6 各因素交互作用的响应曲面Fig.6 Responsive surface for the interaction of various factors

由各个响应面(图6)可知，响应值存在最大值。利用Design-Expert 8.06软件分析计算得出理论最佳提取工艺为料液比1∶28.12、超声时间69.87 min、超声功率410.23 W、乙醇体积分数83.43%，提取率为5.02%。结合实际选择超声温度80 ℃，料液比1∶28、提取时间70 min、超声功率400 W、乙醇体积分数83%。在此条件下，重复试验3次，锈毛莓总三萜的提取率为5.06%，与理论值接近，说明该方程与实际拟合性较好。

2.3抗氧化活性

2.3.1对·OH的清除作用。不同浓度总三萜溶液对·OH的清除作用如图7所示，在浓度范围内呈良好的量效关系，根据非线性拟合得到VC的IC50=0.309 mg/mL，锈毛莓总三萜的IC50=9.467 mg/mL，说明锈毛莓总三萜具有较弱的清除·OH的能力，与VC清除能力相差较大。

图7 锈毛莓总三萜对·OH的清除能力Fig.7 Scavenging activity of total triterpenes from Rubus reflexus to ·OH

2.3.2对DPPH·的清除作用。由图8可知，随锈毛莓总三萜浓度的升高，其对DPPH·的清除能力不断增强，在试验浓度范围内呈良好的量效关系，根据非线性拟合得到VC的IC50=0.023 mg/mL，锈毛莓总三萜的IC50=0.097 mg/mL，说明锈毛莓总三萜具有较强清除DPPH·的能力，且当达到较高浓度时，可基本清除。

2.3.3对ABTS+·的清除作用。由图9可知，在试验浓度范围内，随着锈毛莓总三萜浓度的升高，其对ABTS+·的清除能力不断增强，且呈现较好的量效关系，根据非线性拟合得到VC的IC50=0.019 mg/mL，锈毛莓总三萜的IC50=0.047 mg/mL。结果表明，锈毛莓总三萜对ABTS+·具有较强的清除作用，但其清除能力较VC弱。

图9 锈毛莓总三萜对ABTS+·的清除能力Fig.9 Scavenging activity of total triterpenes from Rubus reflexus to ABTS+·

3 结论与讨论

试验以熊果酸为标准品，选用香草醛-冰醋酸显色法测定总三萜含量，通过波长400～700 nm全波段扫描，确定最佳检测波长为546 nm。采用超声提取法，在单因素试验的基础上，利用Design-Expert 8.06软件进行响应面优化，得到最佳提取工艺条件为超声温度80 ℃、料液比1∶28、超声时间70 min、超声功率400 W、乙醇体积分数83%时，锈毛莓总三萜提取率为5.06%。

通过试验，发现用75%乙醇可使三萜浸膏完全溶解，故在抗氧化试验中以75%乙醇作为空白对照。体外抗氧化活性研究结果显示，锈毛莓总三萜类的抗氧化能力具有浓度效应，尤其对DPPH·和ABTS+·的抗氧化能力较为显著。因此，进一步加强锈毛莓三萜类化合物的研究，对于了解锈毛莓的有效活性成分和药效学研究、指导临床应用具有重要意义。