王延来，谢寿安，赖 青，巩雪芳，杨 平，吕淑杰，李 冬

(西北农林科技大学，陕西杨陵 712100)

花椒窄吉丁(AgriluszanthoxylumiHou)隶属于鞘翅目(Coleoptera)吉丁虫科(Bupresdae)窄吉丁属(Agrilus)，主要分布于我国北方主要的花椒产业区，以陕西、甘肃发生严重[1]，在山西、山东、河南、四川等省也有大范围分布。该虫发生规律为一年一代，幼虫取食韧皮部[2]，老熟后在花椒蛀干木质部的孔道中过冬，次年2月至4月上旬开始活动，下旬开始化蛹，5月上旬为化蛹初期，中下旬为化蛹盛期， 6月中下旬为羽化盛期，7月中旬至8月初基本羽化完毕，成虫体多具有褐色或灰褐色金属光泽。雌虫多产卵于树皮缝隙或树枝分叉处，少数雌虫产卵于近主干侧枝的叶面下。幼虫危害可持续至11月下旬，然后陆续越冬，整个幼虫时期长达240～280 d[3]。花椒窄吉丁仅危害3年生以上的花椒苗木，或干径1.5 cm以上的枝干，以树干直径大小为依据，冻害有利于虫害的发生[4]。研究发现，花椒窄吉丁的危害程度与所分布椒园的地势和地形无关[5]。目前国内对花椒窄吉丁的研究，大多集中于化学防治[6-7]、生物学特性及其综合防治方面[8-9]，对花椒窄吉丁触角感器和花椒窄吉丁天敌的研究也有相关报道[10-11]，但利用生物信息素对花椒窄吉丁的防治研究甚少，仅车显荣[12]于2018年首次利用信息素对花椒窄吉丁进行田间诱捕，结果表明花椒窄吉丁可被乙酸芳樟酯、α-水芹烯、月桂烯、(1R)-(+)-柠檬烯和顺-9-十六烯醛等气味物质引诱，且引诱效果较好。

植物挥发物对昆虫的影响主要表现在昆虫的定向、取食、交配、产卵等多种行为过程中，这是植物与昆虫长期选择、协同进化的结果[13]。不同品种寄主植物挥发物化学组分和相对含量不同，陈智明等[14]利用气相色谱-质谱联用法对长叶刺葵、丝葵和软叶刺葵3种棕榈科植物挥发物进行鉴定，结果发现挥发物组分主要为醇类和萜烯类，此外还包括酯类、醛类和烷烃等。孙浩然等[15]对罗勒、紫罗勒、丁香罗勒和绿罗勒4种罗勒进行挥发物的分析与鉴定，结果发现罗勒、紫罗勒、丁香罗勒和绿罗勒的叶片挥发物中分别检测出28、31、30和25种物质，主要为萜烯类、醇类、醛类和酯类化合物，且不同种罗勒挥发物成分的种类和释放量间存在明显差异。寄主果实挥发物可能为昆虫找寻食源、栖息地和产卵地提供有力信号[16]，目前已经发现杨梅不同成熟度的果实及其挥发物对斑翅果蝇的定向行为有重要的影响[17]；井上蛀果斑螟更倾向于在寄主果实中产卵[18]。

利用昆虫信息素防治害虫具有灵敏度高、选择性强、无毒、不污染环境、不杀伤天敌、不易产生抗药性等优势，是一种新型防治技术，已成为当今世界害虫综合管理的主要方向之一[19-20]；特别是利用信息素大量诱捕害虫和干扰害虫的交配研究已有较多报道。笔者通过对鞘翅目昆虫花椒窄吉丁高发期不同品种的寄主果实挥发物进行提取、分析与鉴定，旨在为筛选花椒窄吉丁类信息素化合物引诱剂或驱避剂及其寄主选择机制研究和绿色防控技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1花椒果实及供试昆虫。花椒果实于2018年6月下旬(蓝田县花椒窄吉丁高发期)采集自陕西省西安市蓝田县普化镇山地附近的花椒园，选取大红袍椒、凤椒和狮子头椒3个品种的植株，剪下花椒植株东西南北中5个方位的果实，分别装入采集袋中密封带回实验室，-4 ℃保存。花椒窄吉丁成虫于2018年6月下旬采自陕西省西安市蓝田县普化镇附近山地的椒园。借助捕虫工具捕捉栖息在叶片上的成虫，而后根据其体型大小放入事先扎好孔的1.5 mL或2 mL离心管中，内置1片新鲜嫩叶供其取食，并编号放入虫笼中。带回实验室于体视镜下区分成虫性别， 25 ℃下饲养，定期清理死虫、粪便和更换新鲜椒叶。

1.1.2仪器与设备。气相色谱-质谱联用仪GC-MS(型号：GCMS-QP2010SE；生产厂家：岛津科技科技有限公司；日本)。固相微萃取(SPME)装置：SPME手动进样手柄，采用DVB/CAR/PDMS萃取头(纤维头)(美国Supelco公司)；固相微萃取搅拌加热平台、20 mL螺纹铁盖进样瓶、植物组织研磨仪、滤纸、DB-5MS弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、微量进样器、分析天平等。

1.2方法

1.2.1挥发物的制备。将3种品种(大红袍椒、凤椒、狮子头椒)花椒果实剪碎，分别置于分析天平上，称取4.5 g，放入植物组织研磨仪进行研磨，至小颗粒状或半固体匀浆状。而后放置于20 mL螺纹铁盖样品瓶中，约占瓶身的50%。加盖密封后，置于50 ℃的恒温台上平衡10 min，保证样品瓶上部的挥发性气味物质充分饱和，然后将固相微萃取(SPME)装置的针头插入样品瓶中上部的空白处，轻轻地推出纤维头并固定固相微萃取装置的手柄，从萃取纤维头推出后开始计时，吸附30 min后，利用GC-MS于250 ℃下解析3 min。

1.2.2挥发物的GC-MS分析与鉴定。采用直接进样法，利用气象色谱-质谱联用仪GC-MS对花椒果实挥发物进行提取与分析。GC条件：色谱柱利用DB-5ms毛细管柱(30 m×0.25 mm ID，膜厚0.25 μm)。进样量为10 μL，进样口温度为250 ℃；柱温箱升温程序：60 ℃保持2.5 min，6 ℃/min升至190 ℃，然后以10 ℃/min升温至 230 ℃，维持 10 min，载气为高纯He(99.999%)。

MS 条件：电子轰击离子源 (EI )，电子能量为70 e V，扫描质量范围为35～400 amu。各挥发物成分与质谱库 (NIST2011 )标准化合物的质谱图进行核对，然后根据有关花椒挥发物研究的文献做参照，进而确定各色谱峰对应的物质结构，根据峰面积归一化法进行定量。

2 结果与分析

2.1花椒果实挥发物的GC-MS分析

2.1.1大红袍椒。通过GC-MS对大红袍椒果实挥发物进行定性定量分析，发现大红袍椒果实挥发物中共鉴定出74种物质，占峰面积的99.92%，总离子图见图1。由图1可知，烯类化合物25种(总量86.67%)，以d-柠檬烯的相对含量最多(30.87%)；醇类化合物17种(总量9.50%)，以Gamma-萜品醇的相对含量最多(7.32%)；酯类化合物14种(总量2.35%)，以(±)-α-乙酸松油酯的相对含量最多(1.15%)；烷类化合物7种(总量0.29%)；醛类化合物6种(总量0.33%)；酮类化合物1种(总量0.87%)；萘类化合物2种(总量0.11%)；氯类化合物1种(总量0.01%)；其他化合物1种(总量0.03%)。

图1 大红袍椒果实挥发物总离子图Fig.1 The volatiles total ion of Zanthoxylum bungeanum Dahongpao fruit

2.1.2凤椒。通过GC-MS对凤椒果实挥发物进行定性定量分析，发现凤椒果实挥发物中共鉴定出64种物质，占峰面积的99.95%，总离子图见图2。由图2可知，烯类化合物25种(总量60.48%)，以d-柠檬烯的相对含量最多(33.82%)；醇类化合物13种(总量14.56%)，以Gamma-萜品醇的相对含量最多(8.57%)；酯类化合物13种(总量23.83%)，以乙酸芳樟酯的相对含量最多(20.99%)；烷类化合物7种(总量1.11%)；醛类化合物3种(总量0.06%)；酮类化合物1种(总量0.11%)；萘类化合物1种(总量0.05%)；其他化合物1种(总量0.03%)。

图2 凤椒果实挥发物总离子图Fig.2 The volatiles total ion of Zanthoxylum bungeanum Feng fruit

2.1.3狮子头椒。通过GC-MS对狮子头椒果实挥发物进行定性定量分析，发现狮子头椒果实挥发物中共鉴定出77种物质，占峰面积的99.99%，总离子图见图3。由图3可知，烯类化合物26种(总量86.51%)，以d-柠檬烯的相对含量最多(32.21%)；醇类化合物19种(总量9.13%)，以Gamma-萜品醇的相对含量最多(5.69%)；酯类化合物14种(总量3.17%)，以(±)-α-乙酸松油酯的相对含量最多(1.22%)；烷类化合物9种(总量0.52%)；醛类化合物5种(总量0.28%)；萘类化合物3种(总量0.20%)；苯类化合物1种(总量0.11%)。

图3 狮子头椒果实挥发物总离子图Fig.3 The volatiles total ion of Zanthoxylum bungeanum Shizitou fruit

2.23种品种花椒果实主要挥发物种类及相对含量的比较通过虫害高发期3种品种花椒果实挥发物的GC-MS总离子图，采用峰面积归一化法求出挥发性物质中各组分的相对含量，利用气相色谱质谱联用仪和计算机联机系统对各挥发物组分进行定性，结合相关资料人工检索鉴定其化学组成。

3种品种花椒果实主要挥发物(相对含量>0.5%)的对比见表1。由表1可知，大红袍椒、凤椒和狮子头椒果实挥发物中分别含有74、64和77种化学物质，主要为烯类、醇类、酯类、烷类和醛类化合物，此外，含有少量的酮类、萘类等化合物。

比较3种品种花椒果实的主要挥发性物质在化学组成和相对含量之间的差异发现，大红袍椒、凤椒和狮子头椒果实的挥发物均以d-柠檬烯含量最多，且相对含量差异不大，由此推测d-柠檬烯可能是花椒果实挥发物的主要成分。大红袍椒和狮子头椒果实挥发物中含量其次均为月桂烯、桧烯和罗勒烯等；而凤椒含量其次为乙酸芳樟酯、桧烯和Gamma-萜品醇，可见不同品种花椒果实在挥发物化学组分和相对含量上具有一定差异。3个品种花椒果实中相对含量大于0.5%的21种挥发性物质中，除d-柠檬烯和(±)-α-乙酸松油酯外，其他挥发物相对含量均差异显著(P<0.05)。对比研究发现，大红袍椒和狮子头椒果实挥发物的组分和相对含量差异不大，但与凤椒果实挥发物差异较大。由表1可知，胡椒酮为大红袍椒果实挥发物的特有成分；2-甲基二十烷为凤椒果实挥发物的特有成分；杀那脱为狮子头椒果实挥发物的特有成分。右旋大根香叶烯和(R)-1-甲基-5-(1-甲基乙烯基)环己烯在大红袍椒和凤椒果实中均含有，但狮子头椒果实中未检测到这2种挥发性物质。凤椒果实挥发物中月桂烯和罗勒烯的相对含量(7.47%、1.60%)显著低于大红袍椒(17.88%、11.57%)和狮子头椒(19.60%、10.11%)，存在极显著差异(P<0.01)；但乙酸芳樟酯和芳樟醇的相对含量(20.99%、4.91%)显著高于大红袍椒(0.48%、0.44%)和狮子头椒(0.89%、0.45%)；存在极显著差异(P<0.01)。

3 结论与讨论

寄主植物挥发物作为昆虫的信息素来源之一，在昆虫的寄主选择和行为定位中扮演着重要角色[21]，指引其寄主选择、取食、交配、产卵等多种行为[22]。植物受虫害后诱导产生的植物挥发物对昆虫的行为具有一定的调控作用，使其对寄主植物的偏好或拒避程度加强[23]。郭丹丹等[24]对双斑长跗萤叶甲的行为反应测定结果表明，棉花和玉米挥发物中的d-柠檬烯对双斑长跗萤叶甲雄虫具有显著的引诱作用，该研究通过对花椒窄吉丁高发期3种不同品种的寄主果实挥发物进行提取与鉴定，结果发现d-柠檬烯的相对含量均最高，故而猜测花椒果实中d-柠檬烯很可能是造成花椒窄吉丁高发的主要挥发物之一。研究发现5%d-柠檬烯可溶液剂可明显抑制柑橘全爪螨卵的孵化和灭杀幼螨、红火蚁等害虫[25-26]。此外，d-柠檬烯还具有良好的医学研究价值，付柏婷等[27]研究发现d-柠檬烯可显著保护衣霉素(Tm)诱导的胰腺MIN6细胞损伤。但d-柠檬烯对花椒窄吉丁是否具有引诱或驱避作用还需进一步进行野外大田试验。

花椒窄吉丁入侵后对花椒挥发物成分影响的研究发现，乙酸芳樟酯在受害株各部位均有发现，但未在健康株中发现[28]，对花椒窄吉丁的田间诱捕研究发现，田间诱捕花椒窄吉丁的最好诱芯为乙酸芳樟酯+α-水芹烯+月桂烯+(1R)-(+)-柠檬烯+顺-9-十六烯醛[10]。研究发现顺-9-十六烯醛是多种昆虫[29-32]的信息素成分，并已被成功研发成性诱剂，但顺-9-十六烯醛是否是花椒窄吉丁的性信息素成分还有待通过生物学等活性测定方法继续深入探讨。该研究发现凤椒果实挥发物中乙酸芳樟酯的相对含量显著高于大红袍椒和狮子头椒，高出20～25倍；但大红袍椒和狮子头椒果实挥发物中月桂烯的相对含量均高出凤椒2倍以上，由此猜测乙酸芳樟酯和月桂烯很可能是造成花椒窄吉丁高发的主要挥发性成分，故而推断花椒窄吉丁对凤椒的趋避程度高于大红袍椒和狮子头椒。特殊的绿叶气体可作为利他素具有增强信息素的功能[33-36]，寄主植物挥发物往往对昆虫释放的信息素起广泛的增效作用[37]，Grant等[38]对白蜡窄吉丁的野外诱捕研究发现在白蜡窄吉丁性信息素中加入3-己烯醇后对白蜡窄吉丁雄虫具有显著的引诱作用，该研究中柠檬烯、月桂烯和乙酸芳樟酯对花椒窄吉丁是否具有性信息素增效剂的作用尚不清楚，故期望在今后研究中能够实现野外试验验证其对花椒窄吉丁信息素的响应机制。

固相微萃取/气相色谱/质谱(SPME/GC/MS)联用技术是常用的植物挥发物提取方法，具有高效率、操作简便等优势，史睿杰等[39]采用固相微萃取/气相色谱/质谱(SPME/GC/MS)联用技术成功分析了青海云杉枝条和针叶中的挥发性化合物，并鉴定出65种化学成分。该研究利用固相微萃取/气相色谱/质谱(SPME/GC/MS)联用技术分析和鉴定3种品种花椒果实挥发物成分，发现胡椒酮为大红袍椒果实挥发物的特有成分；2-甲基二十烷为凤椒果实挥发物的特有成分；杀那脱为狮子头椒果实挥发物的特有成分。胡椒酮已被证实为对玉米象有显著的引诱作用[40]，2-甲基二十烷已被证实为木麻蛾(LymantriaxylinaSwinhoe)的性信息素成分[41]，杀那脱又名敌稻瘟，被证实为一种杀菌剂，能抑制孢子发芽，此外，杀那脱还对昆虫具有强烈的毒杀和抑制作用[42]。胡椒酮、2-甲基二十烷和杀那脱能否作为花椒窄吉丁的信息素增效剂仍需进一步野外大田试验验证。对比研究花椒窄吉丁高发期不同品种寄主果实挥发物，可筛选出不同品种花椒果实特有的挥发性气味物质，故而猜测花椒窄吉丁对不同品种寄主的趋向性或趋避性可能与寄主植物特有的挥发性物质有关。

表1 花椒窄吉丁虫害高发期不同品种花椒果实挥发物成分及相对含量的比较

注：“—”表示含有该物质但相对含量不足0.5%，“— —”未检测到。相对含量低于0.5%的成分且3种样品中同时出现的挥发性微量组分表格中未予列出。同行数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

Note: "—" means it contains the substance but the relative content is less than 0.5%, "— —" is not detected. The components with relative content less than 0.5% and volatile trace components occurring simultaneously in the three samples are not listed. The value in the table is the average value of 3 replicates, and different lowercase letters in the same line mean significant differences (P<0.05)

植物挥发物是指引植食性昆虫寄主定向行为的主要因素[43]，对寄主植物花椒健康株和受害株的嫩枝、叶、韧皮部挥发物研究发现，花椒叶片中分离鉴定出56种挥发性成分，主要为罗勒烯、石竹烯和α-蒎烯；嫩枝中分离鉴定出57种挥发性成分，主要为石竹烯、荜澄茄油烯、乙酸香叶酯和α-蒎烯；韧皮部中分离鉴定出38种挥发性成分，主要为石竹烯、α-蒎烯、律草烯和月桂烯[44]。非寄主植物挥发物对昆虫的行为也具有一定的调控作用，研究发现非寄主植物冷杉挥发物对云杉八齿小蠹有驱避作用[45]。植食性昆虫对不同浓度同种植物挥发物表现出不同的生理活性，存在一个最佳的剂量范围[46]，对褐飞虱非寄主植物水稻挥发物研究发现，褐飞虱雌成虫对不同含量水稻挥发物芳樟醇的选择行为存在一定差异，含量1 μL的芳樟醇对褐飞虱具有显著引诱作用，含量10 μL以上时则表现为拒避作用，含量15 μL以上时则具有极显著的拒避作用。该研究仅提取并分析鉴定了花椒窄吉丁主要的3种品种寄主植物果实挥发物，而对花椒窄吉丁其他品种寄主植物挥发物和非寄主植物挥发物没有研究，Andersson等[47]研究发现欧洲云杉八齿小蠹对寄主植物和非寄主植物的挥发物都有显著反应，云杉八齿小蠹为害后自身产生的一种信息素物质可大量吸引云杉八齿小蠹，这种信息素物质已被证实为欧洲云杉八齿小蠹聚集信息素的一种。期望在今后对花椒窄吉丁的研究中也能够实现对其非寄主植物挥发物的成分和相对含量分析，以丰富花椒窄吉丁生物防控信息素种类。该研究对筛选出的挥发性化合物并未进行野外大田试验验证，期望在今后的研究中能够实现对花椒窄吉丁进行野外试验验证，从而筛选出最佳复配化合物诱芯，为进一步揭示花椒窄吉丁寄主侵害机理提供理论依据，为筛选和制备花椒窄吉丁生物防控引诱剂和驱避剂提供理论和技术支撑。