赵一鹤，李 沁，夏 菁，施 蕊，陈 薇，邹 洁，张静美

(1.云南省林业科学院，云南昆明 650021；2.西南林业大学轻工与食品学院，云南昆明 650024；3.云南林业职业技术学院，云南昆明 650021)

辣木(Moringaoleifera)又称为鼓槌树(drumstick tree)，因其具有辛辣味的根而得名[1-2]，是辣木亚目(Moringineae)辣木科(Moringaceae)辣木属(MoringaAdans.)植物的统称[3-4]，原产于热带及南亚热带的干旱或半干旱区域，在我国未见自然分布，目前我国已将其作为经济型植物引进种植。

自由基是一类具有不成对电子的原子和基团，是机体氧化反应中产生的有害物质，具有强的氧化性，可损害机体组织和细胞，进而引起慢性毒性和细胞衰亡作用，存在于植物和动物细胞中，是生命体细胞凋亡的一个重要诱因。体内活性氧自由基包括超氧阴离子自由基、羟自由基、脂氧自由基、二氧化氮和一氧化氮自由基等，本身具有一定的功能，但过多的活性氧自由基就会有破坏行为，导致人体正常细胞和组织损坏，从而引起多种疾病，如心脏病、老年痴呆症、帕金森病和肿瘤。外界诱因会使人体产生更多活性氧自由基，使核酸突变，这是人类衰老和患病的根源。因此，抗氧化作用成为人们维护健康所关注的热点，各类抗氧化剂和抗氧化保健日化品成为热销产品。

Sholapur等[5]研究结果表明，辣木能够抑制周缘组织内由地塞米松诱导的胰岛素抗性。Jaiswal等[6]通过体外和体内试验证实辣木叶片具有显著的抗氧化活性，能保护正常人及糖尿病患者免受氧化胁迫的损伤。辣木籽油因含辣木多糖，具有一定的抗氧化活性，辣木叶抗氧化活性的研究鲜见报道。国内引进时间较短，目前对辣木的研究主要集中在引种栽培[7-8]、营养成分[9-10]以及辣木油的提取工艺[11-12]等方面，关于辣木生物活性的研究较少[13-14]。笔者对辣木叶乙醇初提物用不同极性的溶剂进行萃取，得到辣木叶石油醚提取物、二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物，采用DPPH(二苯代苦味酰基)和邻苯三酚自氧化法对辣木叶的抗氧化活性进行测定。通过不同的抗氧化活性测定，明确辣木叶中具有抗氧化活性的萃取物部分，以期为辣木叶中具有抗氧化活性的化合物的进一步分离奠定基础，也为辣木叶开发成天然抗氧化剂或天然日化产品提供参考依据。

1 材料与方法

1.1辣木叶辣木鲜叶样品采自云南省大理州宾川县，将其阴干，备用。

1.2仪器旋转蒸发仪、UV-紫外分光光度计、循环水式多用真空泵、电炉、电子天平、移液管、移液枪、胶头滴管、试管、培养皿、镊子。

1.3试剂石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醇、蒸馏水、DPPH、无水乙醇、抗坏血酸。

1.4原材料处理将辣木叶用75%的乙醇冷浸3次，合并3次滤液，于55 ℃下旋蒸浓缩，再依次用等体积石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯对所得浸膏进行萃取，要求每种试剂都萃取3次，以达到萃取层基本无杂色。合并每种溶剂所得萃取液，减压浓缩至干。萃取结束后，得到3层浓缩浸膏，即石油醚层浸膏、二氯甲烷层浸膏及乙酸乙酯层浸膏。

1.5抗氧化活性测定

1.5.1溶液的配制。

1.5.1.1DPPH抗氧化法。精密称取辣木各提取层0.1 g，用95%乙醇溶解并定容于50 mL量瓶，摇匀，超声20 min，作为母液。精密称取2 mg DPPH，加无水乙醇40 mL，超声5 min。用分光光度计在517 nm处测得吸光度，由此来计算抗氧化能力。

1.5.1.2邻苯三酚自氧化法。样品溶液：精密称取0.300 g样品，加10 mL缓冲液，备用。0.1 mol/L Tris：精密称取1.21 g Tris，0.037 2 g EDTA，用蒸馏水溶解并定容于100 mL容量瓶中；0.1 mol/L HCl：0.85 mL 36%HCl溶液，用蒸馏水溶解并定容于100 mL容量瓶中；pH 8.2 Tris-HCl缓冲液：50 mL 0.1 mol/L Tris，22.9 mL 0.1 mol/L HCl蒸馏水定容于100 mL蒸馏水；10 mmol/L邻苯三酚：精密称取0.630 6 g邻苯三酚定容于100 mL容量瓶中。

1.5.2DPPH抗氧化法测定。按表1分别取2 mL不同浓度(100、200、300、400、500 μg/mL)样品溶液，加入2 mL DPPH溶液，混合均匀。室温放置30 min后于517 nm处测吸光值，用抗坏血酸(VC)作为阳性对照。

表1 DPPH法试剂加入量

计算样品对DPPH自由基的清除率：

DPPH清除率= [1-(A1-A3)/A2]×100%

式中，A1为2 mL样品溶液+2 mL DPPH溶液的吸光值；A2为2 mL无水乙醇+2 mL DPPH溶液的吸光值；A3为2 mL样品溶液+2 mL 无水乙醇的吸光值。

1.5.3邻苯三酚自氧化法测定。取50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.2)4.5 mL，置于25 ℃水浴中保温20 min，按表2依次加入不同浓度(200、400、600、800、1 000 μg/mL)样品溶液、邻苯三酚溶液和蒸馏水，混匀后于25 ℃水浴中反应5 min，每30 s在325 nm处测定吸光值。

表2 邻苯三酚法试剂加入量

计算样品对超氧阴离子自由基(O2·-)的抑制率：

邻苯三酚自氧化率=(第4分钟的OD325-第1分钟的OD325)/3

抑制率=(邻苯三酚自氧化率-加样后邻苯三酚自氧化率)/邻苯三酚自氧化率× 100%

2 结果与分析

2.1辣木叶提取物对DPPH自由基的清除作用从图1可以看出，辣木叶石油醚层具有抗氧化活性，并且随着样品浓度的增大，辣木叶石油醚层对DPPH自由基的清除能力逐渐增强，在样品浓度为500 μg/mL时趋于平缓，清除率达86.07%；辣木叶二氯甲烷层对DPPH自由基的清除能力随着样品浓度的增大逐渐增强，在浓度为300 μg/mL时趋于平缓，清除率达89.32%；辣木叶乙酸乙酯层对DPPH自由基的清除能力逐渐增强。在浓度为200 μg/mL时趋于平缓，清除率达92.06%。

辣木提取物的石油醚层、二氯甲烷层和乙酸乙酯层都对DPPH自由基具有一定的清除作用。同时，乙酸乙酯层清除DPPH自由基的能力强于二氯甲烷层，而二氯甲烷层的清除能力强于石油醚层。并且在相同浓度梯度下，辣木叶各个提取层清除DPPH自由基的能力低于阳性对照组VC。

图1 辣木叶提取物对DPPH自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effect of the extract from the leaves of Moringa oleifera on DPPH radical

2.2辣木叶提取物对超氧阴离子自由基的清除作用由图2可知，辣木叶石油醚层提取物对超氧阴离子自由基的清除率较低，在样品浓度达1 000 μg/mL时为19.31%，而二氯甲烷层提取物在样品浓度为800 μg/mL时清除率为24.81%，相对乙酸乙酯层对超氧阴离子自由基的清除率较低。相同条件下，乙酸乙酯层提取物在浓度为400 μg/mL时，对超氧阴离子自由基的清除率达36.10%，和其他提取物相比，其抗氧化作用较强，虽然和阳性对照物VC相比，对超氧阴离子自由基的抑制率还是较低，但该试验采用的材料是辣木叶提取物而不是单体，而VC为单体化合物，因此下一步将考虑把辣木叶乙酸乙酯层进行分离纯化，获得活性单体化合物再进行抗氧化活性研究。

辣木叶提取物的石油醚层、二氯甲烷层和乙酸乙酯层都对超氧阴离子自由基具有一定的清除作用。同时，乙酸乙酯层对超氧阴离子自由基的抑制能力强于二氯甲烷层，而二氯甲烷层的抑制能力强于石油醚层。在相同浓度梯度下，辣木叶各个提取层对超氧阴离子自由基的抑制能力均低于阳性对照组VC。

图2 辣木叶提取物对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effect of the extract from the leaves of Moringa oleifera on superoxide anion radical

3 结论与讨论

该研究对辣木叶乙醇初提物用不同极性的溶剂进行萃取[15-16]，得到辣木叶石油醚提取物、二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物，并同时进行抗氧化活性试验。植物抗氧化测定方法主要集中在脂质体过氧化、自由基清除率和抗过氧化物歧化酶等方面，其中DPPH法是最常用的抗氧化测定方法，DPPH法是基于DPPH有机溶剂在520 nm处有最大吸收波长，如抗氧化剂同时存在时与其孤对电子配对而吸收减弱的原理检测抗氧化剂对自由基的清除效率，是评价抗氧化剂最常用的方法。邻苯三酚法则属于抗过氧化物歧化酶活性测定范围，利用邻苯三酚在自氧化过程中产生有色中间体和超氧阴离子，利用SOD分解而间接推算酶活力的方法。该研究通过比较不同的抗氧化活性，明确辣木叶中的抗氧化活性部位，通过2种抗氧化方法的比较，确定辣木叶提取物中乙酸乙酯提取物的抗氧化作用主要为对自由基的清除作用，为下一步开发辣木叶天然抗氧剂提供了理论基础[16]。

在抗氧化试验中，测定辣木叶石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯3个提取层的DPPH自由基清除作用，3个提取层均有清除作用，且随浓度的增大而增大，同时在相等的浓度条件下，乙酸乙酯层抗氧化效果最强，其次是二氯甲烷层，再次是石油醚层。植物的抗氧化能力多与其多酚类物质和黄酮类物质的含量有一定的关系，乙酸乙酯层比其他2层抗氧化效果好可能是由于其主要萃取植物中黄酮和多酚成分。虽然各提取层清除DPPH自由基的能力均低于VC，但是在浓度为500 μg/mL以上时，各层对DPPH自由基清除率都为90%左右。

由此可见，辣木叶具有良好的抗氧化性，具有潜在的开发价值。抗氧化剂是食品、医药和化工领域常用和必须使用的辅料和添加剂。化学合成抗氧化剂对身体有一定的毒性和致突变作用，随着消费者对天然健康的需求日益加强，天然抗氧化剂将是未来抗氧化剂研究和开发的重点。辣木叶是一种极具开发潜力的天然抗氧化剂，其在2012年被列入国家卫生部批准的新资源食品目录，使得辣木叶的综合开发利用成为可能，作为食品级原料，其安全性已经得到认可，如能在此基础上对其功能性进行开发利用，将扩大辣木叶的价值和利用范围。辣木叶作为一种新型抗氧化剂或抗衰老保健品，也可以对其单体化合物的抗氧化功能做进一步研究，以期开发出相关医药产品。