康战方 植新培 欧阳一蕙 高军 张恬 印大中

(1广州医科大学附属第六医院 清远市人民医院，广东 清远 511518；2清远职业技术学校)

随着社会的发展及人民生活水平的提高，糖尿病的发病率在我国及全球范围内迅速攀升〔1〕。2010年我国18岁及以上成人样本中，根据国际最新临床诊断标准进行诊断的糖尿病估测患病率为11.6%，约1.39亿人〔2〕。目前，胰高血糖素样多肽(GLP)-1受体(GLP-1R)激动剂及二肽基肽酶(DPP)-4抑制剂(能抑制体内活性GLP-1被DPP-4酶降解)用于2型糖尿病治疗并具有广泛的应用前景。临床研究表明，GLP-1R激动剂除了刺激胰岛素分泌、降血糖之外还具有保护心血管及大脑等功能〔3〕。GLP-1通过与其特异性的G蛋白耦联受体-GLP-1R相结合而发挥功能。研究表明，高糖和高脂分别能损伤β细胞中GLP-1R的表达，并影响其信号通路。本文旨在研究高糖、高脂协同条件下(糖脂毒性)对INS-1E β细胞中GLP-1R的表达及exendin-4保护作用的影响。

1 材料与方法

1.1材料 小牛血清、RPMI1640培养基、β-巯基乙醇、青链霉素双抗、胰蛋白酶均购自Hyclone。无糖RPMI1640培养基粉末、牛血清白蛋白(BSA)、棕榈酸钠(无脂肪酸)及噻唑蓝(MTT)购于美国Sigma。BrdU抗体从CST 获得。TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购于南京诺唯赞生物科技有限公司。总RNA提取试剂、反转录反应试剂和SYBR Green I荧光定量PCR试剂从Takara公司购买。

1.28 mmol/L的棕榈酸-BSA溶液配置 根据我们之前发表的论文配置〔4〕。主要步骤如下：首先100 mmol/L RPMI1640培养基中加入10 g BSA和2.5 ml的HEPES (1 mol/L)轻轻混匀，避免过多气泡产生。完全溶解后取50 ml溶液放入无菌血清瓶中并且加入111.4 mg棕榈酸钠，控制温度在37℃左右(不超过38℃)用磁力搅拌器搅拌约3 h棕榈酸钠完全溶解。最后用一次性滤器除菌、分装4℃保存备用。剩余的约含10.5%BSA的培养基不加入棕榈酸钠做相同的搅拌处理用作对照。

1.3细胞培养 大鼠胰岛β细胞系INS-1E由日内瓦大学P.Maechler教授惠赠。细胞培养于RPMI1640培养基中(含有10% 的小牛血清，50 μmol/L β-巯基乙醇，100 U青链霉素双抗)。细胞培养于37℃，95%空气，5%二氧化碳的恒温培养箱中。观察细胞密度约为80%至90%时，细胞用0.25%胰蛋白酶消化、传代(1∶3)或者传于96孔板或6孔板用于实验。当棕榈酸钠处理细胞时，培养基换成不含小牛血清，对照组为含相同浓度BSA的溶液。

1.4荧光定量PCR实验 INS-1E细胞在处理相应时间之后，按照说明书用总RNA提取试剂提取总RNA，然后用反转录试剂盒合成cDNA。荧光实时定量PCR反应采用SYBR Green试剂，在BIO-RAD CFX Connect定量PCR仪器上进行。GLP-1R引物序列正向TGAGAGACCTGCCCTTGGAAC，反向CGAGAGGAAGGCTGATGTAGG。GAPDH用作内参，引物序列正向AGTTCAACGGCACAGTCAAG，反向TACTCAGCACCAGCATCACC。

1.5MTT实验 取对数生长期的INS-1E细胞，消化后以4×104个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中培养过夜。第二天细胞换成无小牛血清的低糖(5 mmol/L)或高糖培养基(30 mmol/L)，并且加入终浓度0.4 mmol/L的棕榈酸或者棕榈酸联合exendin-4(50 nmol/L)继续培养24 h。然后加入20 μl的MTT溶液(终浓度5 mg/ml)培养4 h，弃上清液，每孔加入150 μl的二甲基亚砜(DMSO)溶液，室温下缓慢震荡至结晶物溶解后在酶标仪中读数(检测波长490 nm)。

1.6BrdU免疫荧光 INS-1E细胞3×105个/孔传于含无菌盖玻片的6孔板中，第2天细胞贴壁后换成低糖或者高糖培养基，并且用0.4 mmol/L的棕榈酸处理24 h后进行BrdU免疫荧光分析。具体步骤为检测前2 h每孔加入终浓度为3 μg/ml的BrdU。然后PBS洗涤后4%多聚甲醛固定15 min，再用PBS洗涤3次后0.3%Triton X-100处理15 min，2 mmol/L盐酸处理30 min后再用0.1 mol/L硼酸盐缓冲液中和。按照免疫荧光常规过程封闭、加入抗BrdU抗体孵育、洗涤和加入二抗，荧光显微镜拍照计数。

1.7细胞凋亡试剂盒(TUNEL)染色 INS-1E细胞3×105个/孔传于含无菌盖玻片的6孔板中，第2天细胞贴壁后换成低糖或者高糖培养基，并且用0.4 mmol/L的棕榈酸处理24 h，后进行TUNEL细胞凋亡分析。按照说明书进行，最后用荧光显微镜拍照计数分析。

1.8统计方法 使用SPSS20.0软件行t检验。

2 结 果

2.1高糖、高脂单独及糖脂毒性条件下β细胞中GLP-1R mRNA的表达 首先，我们选择大鼠INS-1E细胞作为模型，用棕榈酸模拟体内高血脂来进行体外实验。单独高糖(30 mmol/L)或者高脂(0.4 mmol/L棕榈酸)的条件下都能显著降低INS-1E细胞中GLP-1R mRNA表达(分别下降至68.1%±16.7%和55.5%±14.6%)。但是合并高糖、高脂的条件下GLP-1R mRNA表达下降更显著(下降至35.0%±7.9%，均P<0.05)。

2.2高糖、高脂及糖脂毒性条件下对INS-1E细胞增殖的影响 我们进一步用MTT和BrdU染色方法检测了高糖、高脂和糖脂毒性并条件下激活GLP-1R信号通路对INS-1E细胞增殖的影响。MTT结果显示(OD值分别为：低糖，0.78±0.03；低糖+棕榈酸，0.68±0.04：低糖+棕榈酸+exendin-4，0.73±0.02；高糖，0.86±0.05；高糖+棕榈酸，0.71±0.02；高糖+棕榈酸+exendin-4，0.72±0.04)，与低糖相比较，高糖条件下能促进细胞增殖。而高脂对不同葡萄糖培养条件下的INS-1E细胞都有抑制作用。exendin-4能部分保护低糖条件下棕榈酸对INS-1E细胞的抑制作用，而在高糖条件下几乎没有保护作用。BrdU染色结果也得到相似的结果(BrdU阳性细胞统计百分比结果为：低糖，11.1%±2.0%；低糖+棕榈酸，4.2%±1.8%；低糖+棕榈酸+exendin-4，4.8%±1.8%；YM OYVK，14.9%±2.9%；高糖+棕榈酸，4.6%±1.3%；高糖+棕榈酸+exendin-4，4.5%+1.7%)。0.4 mmol/L棕榈酸处理细胞后BrdU阳性细胞比例显著降低。exendin-4减弱了低糖条件下棕榈酸对细胞增殖的抑制作用，但在高糖作用下则无明显影响(图1)。

2.3高糖、高脂及糖脂毒性条件下对INS-1E细胞凋亡的影响及exendin-4的保护作用 我们的培养条件下，高糖对β细胞凋亡影响较小。0.4 mmol/L棕榈酸则显著增加了INS-1E细胞的凋亡，无论是在高糖或低糖条件下。exendin-4能保护低糖条件下棕榈酸诱导的细胞凋亡，但在高糖条件下作用不明显，TUNEL阳性细胞统计百分比结果为：低糖，1.2%±0.8%；低糖+棕榈酸，14.1%±14.4%；低糖+棕榈酸+exendin-4,9.1%±2.2%；高糖，1.3%±0.5%；高糖+棕榈酸，16.8%±4.8%；高糖+棕榈酸+exendin-4，15.1%±4.3%。见图2。

图1 糖脂毒性及exendin-4对INS-1E细胞增殖影响的BrdU免疫荧光结果

图2 糖脂毒性及exendin-4对INS-1E细胞凋亡的影响

3 讨 论

糖尿病是一种多因素决定的代谢性疾病，其发病的根本原因在于胰岛素抵抗(胰岛素相对不足)或者胰岛素β细胞损伤引起的胰岛素分泌减少(胰岛绝对不足)。糖尿病一旦发生，β细胞胰岛素分泌能力将持续降低，包括β细胞量也会减少，直至β细胞衰竭〔5，6〕。尽管具体机制并不清楚，多数研究表明高血糖、高血脂在糖尿病β细胞衰竭中起重要作用〔7〕。肠促胰岛素是口服营养物质后，由胃肠道产生的一类具有促进胰岛β细胞胰岛素分泌、降低血糖的内分泌因子。GLP-1和抑胃肽/葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽(GIP)是2个最重要的肠促胰岛素。目前基于GLP-1R激动剂的药物广泛应用于临床来治疗2型糖尿病〔8〕。我们及其他研究团队发现，高脂、高脂单独条件下都能降低β细胞中GLP-1R的表达、损伤GLP-1R信号通路〔4，9〕。但并没有研究高糖合并高脂，即糖脂毒性对β细胞GLP-1R表达及其信号通路影响。本研究发现糖脂毒性比单独高糖、高脂损伤β细胞GLP-1R信号通路更严重，提示了我们在使用肠促胰岛素类药物治疗2型糖尿病时血脂控制也十分重要。