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(1.上海海洋大学食品学院,上海 201306;2.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室,上海 201306;3.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306;4.上海海洋大学食品热加工工程技术研究中心,上海 201306)

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是最早由Mullis等[1]发明的体外模拟核酸扩增的基因拷贝技术,因核酸呈几何级数暴增,进而使得微观分子达到宏观可视化效果。随着科技发展,生物科学等对于PCR技术也提出了更高要求,荧光定量PCR(Fluorescent quantitative PCR)应运而生,也因其特异、高效、快速等优异的特点被广泛应用于生物科学、农业科学、医药卫生、政治法律等领域[2-5]。

20世纪80年代初,Ross等首次提出了“微生物预测技术”。从此预测微生物学运应而生,正式拉开了预测微生物研究的序幕[6-7]。1990年,欧盟等一些国家对微生物预测技术进行大量研究,建立了相应的微生物数据库,后来,英国、美国、澳大利亚等,开始致力于微生物预测软件的开发与研究。直到现在,世界上最大的微生物预测数据库Combase已经被建立起来,并持续更新数据库。预测微生物学对企业的生产、人们生活等各个方面都具极大作用,以危害分析的临界控制点(Hazard Analysis and Critical Control Point,HACCP)和定量微生物风险评估(Quantitative Microbiological Risk Assessment,QMRA)表现尤为显著[8-9]。

本文主要综述了荧光定量PCR技术和预测微生物学的发展史以及荧光定量PCR在预测微生物学中应用的国内外研究现状,以期推动荧光定量PCR技术在预测微生物学领域应用,进而推动预测微生物学的发展。

1 荧光定量PCR

1.1 荧光定量PCR的分类及其基本原理

传统的微生物定量检测原理是微生物在特定的培养基上产生相应的代谢产物从而进行计数,整个检测过程需要培养基制备、平板培养、菌落计数、生化鉴定等步骤,极其复杂、耗时、耗力[10-12]。实时荧光定量PCR技术,即在反应体系中加入荧光基团,通过荧光信号的实时积累进而监测整个PCR进程,最后通过已知标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。一般常用的定量PCR,包括荧光染料法和水解探针法。

染料法(SYBR Green Ⅰ)[13]:染料法中以SYBR Green I法的应用最为广泛。一种只与双链DNA小沟结合的具有绿色激发波长的染料,结合所有DNA双链小沟。反应体系中,过量的SYBR染料,结合时,SYBR特异掺入DNA双链小沟,发射荧光信号,多余的SYBR不会发射任何荧光信号,保证收集的荧光信号与PCR产物的增加量保持一致。

TaqMan探针法[14-15]:TaqMan探针的基本原理是利用Taq酶的5′核酸外切酶活性,切割与靶序列结合的寡核苷酸探针。探针由5′端标记报告基团,3′端标记淬灭基团构成。反应前,荧光报告基团和荧光淬灭基团形成共振体系,3′淬灭基团抑制5′荧光基团的荧光发射。反应时,当引物延伸至探针结合位置时,Taq酶可以将其切割成小片段,破坏了探针的完整性,稳定的能量传递结构瓦解,发出荧光信号,PCR反应一轮,荧光信号被收集一次,进而实现实时监测整个反应过程。需要特别提出的两个概念:荧光阈值和CT(cycle theshold)值,荧光阈值即预先设定的阈值,通常以PCR反应的第3～15个循环的荧光值作为荧光本底信号,同时以3～15个循环的荧光值增加量标准偏差的10倍设置为荧光阈值。CT值即荧光信号到达该阈值时的循环次数。图1为Taqman探针反应原理图。

图1 Taqman探针反应原理Fig.1 Reaction principle of taqman probe

1.2 荧光定量PCR的特点

荧光定量的靶序列由引物和探针双重保障,确定了其高度特异性,荧光信号的产生和实时收集确定了其高效快速。相比较传统涂布计数法,荧光定量PCR除了快速高效、特异性强、高通量等优势,荧光定量PCR还在以下方面发挥重要作用:检测环境中VBNC(viable but non-culturable)微生物[16-18],确定微生物群落组成以优势类群,对功能微生物类群进行量化[19-21]。PCR-DDGE能确定微生物多样性,Chao等[22]也尝试用PCR-DDGE技术定量建模,但是其也只能是半定量,并不能绝对定量。宏基因组测序技术也能确定微生物种类,但是无法量化[23]。流式细胞仪也可用于计数,但仪器昂贵,操作复杂,进样速度差异,共存杂质等对计数结果的影响都限制了该技术的应用[24]。

荧光定量PCR是基于DNA的扩增技术,因此可能出现假阳性结果,最近有研究人员采取RNA反转录进而对目标样品定量分析[25],新型核酸染料结合死菌DNA以阻止其随后的扩增[26]。RNA不易提取,且易降解,核酸染料操作简单方便,更适合实验室使用。总之,荧光定量PCR应结合其他新技术新材料才能获得更广阔的应用潜力。

2 预测微生物学

2.1 基本原理及其分类

预测微生物学(Predictive Microbiology)是基于微生物学、统计学、计算机学和数学为基础而建立起来的一门新学科,旨在通过用数学的语言来定量描述或预测处在特定的环境下微生物的生长和衰亡规律[27]。预测微生物学模型分类方法很多。依据描述微生物的生长衰亡情况,可分为微生物生长模型和微生物失活模型,依据生长模型的建立方式分类,可分为概率模型和动力学模型。概率模型旨在预测特定事件发生的概率,如在给定时间内某类食品中特定的腐败菌、病原菌或毒素出现或形成的概率,一般用于食品安全性评估。动力学模型描述不同环境因子对微生物生长的影响,即构建相关微生物的生长动力学参数和环境因子之间关系的数学模型,一般用于食品品质预测。

一般,基于变量的类型,按照根据美国的Buchanan和Whiting等[28]的分类方法可把预测微生物学模型分为一级模型或初级模型(Primary Model)、二级模型或次级模型(Secondary Model)和三级模型或专家模型(Tertiary Model)。一级模型,即描述微生物量与时间的函数关系,一般为S型曲线,有Gompertz函数、Logistic模型、Baranyi模型、Huang模型、Stannard方程等。二级模型,即旨在表征一级模型的动力学参数与环境因子之间作用的函数关系,有平方根模型(Square Root Model)或叫Ratkowsky模型、Arrhenius/davery指数模型和响应面方程(Response surface equation)等。三级模型则是依据一级和二级模型的基础建立起来的面向用户的微生物预测软件或数据库，有PMP(Pathogen Modeling Program)、FSP(Food Spoilage Predictor)、FM(Food Micromodel)、FSLP(Fish Shelf Life Predictor)以及最大的Combase网站等,详见表1。

表1 预测微生物模型的分类及其简介[6,27-33]Table 1 Classification of predictive microbiological models and their introduction[6,27-33]

2.2 特点

简单来说,一级模型描述在特定环境下菌量随时间的变化,包括生长模型和失活模型,比较简单最常用的有Baranyi模型和Gompertz方程等。二级模型,描述的是培养过程中的环境因子对微生物生长或存活特性的影响,稍微复杂。三级模型是一级和二级模型的综合,一般表现为方便的电脑应用程序或者数据库,面向用户能提供更加有效直接的预测工具。

3 荧光定量PCR在预测微生物学中的应用现状

利用实时荧光定量PCR代替传统平板计数法具有极大的优势:快速,高效,节约人力物力等。能检测实际食品基质样品,对于检测大批量样品更显优势。以qPCR+microbiological为关键词在web of science核心集合上检索,共有296篇文献。近十一年的文献分布如图2,从2008年的只有6篇到2011的20篇,直到最近5年(2013～2017年)的年文章数量平均在40篇左右。足以显示出荧光定量PCR技术在科研领域的重要地位。而用qPCR+predictive model为关键词在web of science核心集合上检索,则共有164篇文献。近十一年的文献分布如图3。2008年只有6篇2016年达到29篇,近5年(2013～2017年)的年文章数量平均也达到23.4篇。值得提出的是,因为是以关键字检索,所以这两组数据(文献)并非实际研究情况,实际对于用qPCR在预测微生物学方面的研究还是比较欠缺。以qPCR 和预测微生物模型为关键词在web of science(所有集合)上检索一共只有38篇文章,具体见图4。可知qPCR在预测微生物学领域的应用仍有很大潜力。

图3 以qPCR和预测模型为关键词的近十一年的SCI文章数Fig.3 SCI paper number based on qPCR and predictive models in recent eleven years

图4 以qPCR和预测微生物模型为关键词的近十年的文章数Fig.4 Papers number based on qPCR and predictive microorganism models in recent ten years

3.1 国内研究现状

我国国内常见的食源性致病菌有:副溶血性弧菌、沙门氏菌、单增李斯特氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157等[34]。李苗云等[35]用传统涂布计数法来建立冷却猪肉中单增李斯特氏菌生长动力学模型。胡燕等[36]采用平板涂布计数法建立了大肠埃希氏菌在熟肉制品中生长预测模型。于艳艳等[37]利用平板计数法构建原料乳中金黄色葡萄球菌的预测生长模型。李金春等[38]基于平板计数法构建了营养肉汤中金黄色葡萄球菌的致死模型。国内研究人员基本上以涂布计数法为主,构建相应微生物的生长衰亡模型,这种方法耗费大量人力物力。荧光定量PCR技术则多用于定性定量检测。比如郭川等[39]检测了VBNC状态的副溶血性弧菌。於颖等[40]用荧光定量PCR结合核酸染料研究了沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等。他们都没有充分把该技术运用于预测微生物模型的构建,一般相关检测部门也仅利用该技术用于样品的抽查与检测。彭织云等[41]率先运用荧光定量PCR方法建立副溶血性弧菌在即食虾中的生长预测模型,该方法省时省力、特异性好等优点,并指出该方法建立微生物预测模型是未来预测微生物学领域的一种发展趋势。

3.2 国外研究现状

自从预测微生物模型兴起以来,国外就开始以实际食品基质研究各种微生物预测模型。早在1988年Gibson等构建了温度、pH和水分活度对沙门氏菌的影响生长模型[42]。1995年Sutherland等就建立了大肠杆菌O157∶H7在禽肉产品上生长的模型[43]。2001年Lindqvist等用烟熏鲑鱼和鳟鱼为基质构建了李斯特菌的预测模型并评估了其风险[47],Vialette M等在2003年应用建立了在pH、NaCl、温度的相互作用下水产品中李斯特菌的生长模型[48],2005年Parsons D等以家禽肉为培养基质研究沙门氏菌预测模型[49]。Juneja等在2007年运用了Gompertz、Baranyi和Logistic模型研究不同温度下鸡肉中沙门氏菌的生长情况[50]。2008年Hwang等用soudjouk式发酵香肠为基质研究大肠杆菌O157∶H7、李斯特菌鼠伤寒沙门氏菌失活模型[51]。2009年Valero等构建了金黄色葡萄球菌模型研究了温度、pH和水分活度对其的影响等(详见表2)[52]。这些模型大多都基于平板涂布计数法来构建,其难度大且耗费巨大人力、物力和财力。

表2 预测微生物模型构建的部分研究(国外)Table 2 Some studies of predictive microbial models(international)

直到Reichert等在2009年运用平板计数和Real time PCR技术描述了纯培养条件下的单增李斯特菌的生长情况[53],并得出相同结果。为模型构建提供了新的数据获取方式。Ye等在2012年运用荧光定量PCR技术构建了猪肉中单增李斯特菌的一级模型,并提出分子预测模型(molecular predictive model)这个概念[54],肯定了分子预测模型意义。2013年Wang等运用荧光定量PCR构建了电解水处理后的南美白对虾的副溶血性弧菌的生长命运[55]。2014年Ye又用该技术构建了单增李斯特菌与乳酸菌的竞争抑制模型[56]。2015年Zhang等用荧光定量PCR技术构建副溶血性弧菌与单增李斯特菌两株在低温条件下的命运[57]。国外研究人员对应用分子技术构建预测模型研究也处于停滞状态,导致这种局面的原因很大一部分在于PCR技术都基于DNA的扩增,很难排除死菌DNA对其精确度的影响,为克服这一问题,有研究者[25]对在死菌中易降解的RNA进行反转录,再进行实时荧光定量PCR,实现对微生物浓度的间接测定。也有研究者[58]采用荧光定量PCR结合核酸染料特异性结合死菌DNA来提高其精确度。

另外,还有研究者采用宏基因组的方法建立微生物预测模型。Parveen等[59]运用DNA探针技术构建鲜活牡蛎中自然存在的副溶血性弧菌的预测微生物模型;Korem等[60]在Science上发表利用宏基因组学测序技术分析人类肠道菌群的生长动力学,拓展了研究人员构建预测模型的新方式。预测食品微生物学在发展过程中需要寻求新的数据获取方法,各种先进的分子生物学技术需要被应用到实验室和实际工厂企业,最终服务于实际生产。

4 展望

预测微生物学是一门旨在描述和预测微生物的生长衰亡命运的科学,为栅栏技术(Hurdle Technology)、危害分析的临界控制点(HACCP)、良好操作规范(GMP,Good Manufacturing Practices)以及微生物定量风险评价(QMRA)中的暴露评估环节都能提供强有力的理论支撑。在继续发展和研究预测微生物学时,下面问题应当尤其被关注:a. 更贴近实际食品的不同培养基质的预测微生物模型。b. 不同贮藏储运条件下的预测微生物学模型。c. 不同包装材料作用下的预测微生物学模型。d. 多种微生物间复杂相互作用的预测微生物学模型。e. 结合新型分子生物学技术以及计算机技术的预测微生物学模型。

总之,预测微生物模型没有最好,只有更好,无限趋近于最好,就像数学概念“极限”,我们永远达不到“极限”,但能无限趋近于“极限”。正如预测微生物模型,不能因其不是真实情况而否定其巨大作用。因此,各位历史前辈在无限趋近于预测微生物学模型的“极限”的研究,才显得更加有意义。

应用荧光定量PCR在预测微生物模型中的应用时,需要人们摒弃其缺点的同时逐步考虑到更贴合实际的实际样品情形,也应该把所得到的研究结果结合现代网络技术以可视化形式呈现。一方面,在研究预测微生物学模型过程中仍需要不断探索、创新,建立更好更适宜的预测模型。对于实际食品样品基质,以及多种菌株共存的情况,仍然需要基于具体情况对现有的预测模型进行修正甚至建立新的且更适合实际情况的模型。随着计算机和网络技术的发展,需要人们把各种模型与其结合,以最终能向人们提供以面向用户的可视结果而不是预测模型和实验数据的这个方向努力。另外,面对传统获取数据的涂布技术法,耗时、耗力、精确度低等缺点,荧光定量PCR技术在国内外虽然使用已经很成熟,但是大多都停在检测技术上面,没有把它作为工具利用起来,以替代传统涂布计数。对于荧光定量PCR可能出现假阳性的情况,建议应该用新型核酸染料叠氮碘化丙锭(PMA:propidium monoazide)、叠氮碘化乙锭(EMA:ethidium monoazide)结合死菌DNA以阻止定量PCR的随后扩增,从而充分发挥其优点。

目前,很少有人把定量PCR技术与微生物预测模型结合,一定程度上限制了预测微生物的发展。我们倡议研究人员应把荧光定量PCR技术为主的分子生物技术在摈弃其缺点的同时加快应用到模型构建的进程中,进而推动预测微生物学的进一步发展。总之,各种先进的分子生物技术是相互协调互补,而不是排斥,都应充分应用于预测模型的构建,以期提高模型的建立速度,减少研究人员的时间和精力,并最终服务于企业的生产和人们的生活。