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(1.徐州工程学院食品(生物)工程学院,江苏徐州 221018;2.江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室,江苏徐州 221018)

酒精性肝病(Alcoholic liver disease,ALD)为我国第二大肝病,初期表现为脂肪肝,进而发展成肝炎、肝硬化等[1]。氧化应激引起的机体抗氧化防御系统受损和脂质过氧化产物增加,被认为在ALD发病机制中扮演重要角色[2]。肝脏是乙醇代谢的主要场所,长期大量饮酒可产生过量的活性氧和过氧化产物,使肝组织中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)等抗氧化酶活性下降,造成肝细胞损伤[3]。摄入外源抗氧化剂,提高机体抗氧化能力,消除酒精所致的氧化应激,被认为是ALD的有效疗法之一[4]。近年来,在酒精性肝损伤治疗药物的筛选中,天然产物中的三萜类物质受到广泛关注,从灵芝[5]、茯苓[6]、北五味子[7]、蕨麻[8]和垂盆草[9]等大型真菌和植物中分离得到的三萜已被证实具有较好的保肝作用。

东方栓孔菌(Trametesorientalis)为多孔菌科栓孔菌属真菌,可用于肺结核和支气管炎等疾病的治疗[10]。子实体中蛋白含量高约18.01%,脂肪含量低约1.58%,氨基酸组成合理,富含多种矿质元素[11]。多糖和三萜是东方栓孔菌的主要活性成分,东方栓孔菌多糖具有较好抗氧化、免疫调节和抗肿瘤活性[12-13],有关东方栓孔菌三萜的研究却较少。东方栓孔菌子实体中三萜含量约3.52%,高于茯苓、灵芝中的三萜含量,具有较好的体外抗氧化活性[11]。目前有关较高纯度的东方栓孔菌三萜类物质的富集工艺及体内生物活性的研究鲜有报道。大孔树脂吸附法具有高效、经济、易再生等优点,广泛用于天然产物中多酚、黄酮和三萜等某一类化合物总组分的纯化,大孔树脂纯化三萜类物质应用广泛,许多研究者已经成功利用大孔树脂对三萜类化合物进行纯化和富集[14-16]。

本文采用大孔吸附树脂法对东方栓孔菌三萜粗提物的纯化工艺进行优化,并探究了经大孔树脂纯化后的东方栓孔菌三萜对酒精致急性肝损伤小鼠的保护作用,旨在为东方栓孔菌三萜的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

东方栓孔菌子实体 吉林桦甸;昆明小鼠(SCXK鲁20140007) (20±2) g,济南朋悦实验动物繁育有限公司;丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)、SOD、CAT、GSH-Px、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)测试盒 南京建成生物工程研究所;水飞蓟宾 天津天士力圣特制药有限公司;熊果酸(CAS77-52-1) 上海生工生物试剂;5种供试大孔树脂的部分特性见表1;其他试剂 均为国产分析纯。

表1 五种不同大孔树脂的部分特性Table 1 Partial properties of five different macroporous resins

723C可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;DCTZ-2000多用途恒温超声提取机 北京弘祥隆生物技术股份有限公司;LGJ-18A 冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂;HL-2恒流泵 上海嘉鹏科技有限公司;TGL-16台式高速冷冻离心机 长沙湘仪有限公司;1.6 cm×30 cm层析柱 上海厦美生化科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 粗三萜的提取与含量测定 东方栓孔菌子实体40 ℃烘干后粉碎,过60目筛,称取50 g石油醚脱脂后的粉末,加入750 mL 95%乙醇,置于恒温超声提取机中400 W 50 ℃提取40 min。提取液抽滤后浓缩,-40 ℃冷冻冻干得到三萜粗提物。东方栓孔菌三萜粗提物三萜的质量分数测定参考文献[14]。

1.2.2 5种树脂的静态吸附-解吸特性试验 称取预处理后的5种大孔树脂各1 g,置于三角瓶中,分别加入15 mL东方栓孔菌三萜粗提物溶液(三萜质量浓度为2.627 g/L),在25 ℃下,110 r/min摇床中振荡吸附24 h后过滤,测定滤液中的东方栓孔菌三萜质量浓度,根据公式(1)和(2)计算各种树脂对东方栓孔菌三萜的吸附量(mg/g)和吸附率(%)。

将吸附后的树脂用蒸馏水洗至溶液无色,加入70%乙醇15 mL,振荡解吸24 h,过滤后测定滤液的东方栓孔菌三萜质量浓度,根据公式(3)和(4)计算各种树脂对东方栓孔菌三萜的解吸量(mg/g)和解吸率(%)。

式(1);

式(2);

式(3);

式(4)。

式中:C0、C1和C2分别为三萜初始、平衡和洗脱液质量浓度(g/L);V1和V2分别为提取液和洗脱液体积(mL);m为树脂质量(g)。

1.2.3 吸附等温线制作 在25 ℃下,称取已筛选出的大孔树脂(X-5)14份,每份1 g,置于三角瓶中,加入15 mL质量浓度分别为0、0.147、0.331、0.693、0.930、1.260、1.510、1.820、2.930、3.910、4.880、5.950、6.790、7.910 g/L东方栓孔菌三萜粗提物溶液,振荡吸附24 h,至平衡。以平衡后溶液中的东方栓孔菌三萜质量浓度为横坐标,吸附量为纵坐标,制作东方栓孔菌三萜在X-5树脂上的吸附等温线。将所得吸附等温线数据分别按照Langmuir和Freundlich吸附等温方程进行非线性拟合。

式(5);

式(6)。

式中:Qe和Qm分别为平衡和饱和吸附量(mg/g);Ce为平衡质量浓度(g/L);Kl和Kf分别为Langmuir和Freundlich平衡常数;n为特征参数。

1.2.4 动态吸附与解吸

1.2.4.1 上样质量浓度对吸附穿透曲线的影响 称取适量X-5树脂,湿法装柱(1.6 cm×30 cm)。在2 BV/h流速下,根据预实验结果设置单因素上样质量浓度范围。1.06、2.34和3.12 g/L东方栓孔菌三萜粗提物溶液依次过柱,每1 BV(1 BV表示1倍树脂床体积,约60 cm3)收集1管流出液,测定流出液三萜质量浓度,以上样液体积为横坐标,流出液三萜质量浓度为纵坐标,绘制吸附穿透曲线。

1.2.4.2 上样流速对吸附穿透曲线的影响 根据预实验结果设置单因素上样流速范围。2.34 g/L东方栓孔菌三萜样品液依次在1、2和3 BV/h流速下分别过柱,按1.2.4.1方法绘制吸附穿透曲线。

1.2.4.3 乙醇体积分数对解吸性能的影响 X-5树脂对东方栓孔菌三萜的吸附达到饱和后,根据预实验结果设置单因素乙醇体积分数范围。在2 BV/h流速下,使用50%、70%和90%乙醇分别洗脱X-5树脂,每1 BV收集1管洗脱液,测定洗脱液三萜质量浓度,以洗脱液体积为横坐标,洗脱液三萜质量浓度为纵坐标,绘制洗脱曲线。根据公式(7)计算洗脱率。

式(7)

1.2.4.4 洗脱流速对解吸性能的影响 根据预实验结果设置单因素洗脱流速范围。东方栓孔菌三萜在X-5树脂上饱和吸附后,选用70%乙醇作为解吸液,分别以1、2和3 BV/h流速洗脱X-5树脂,按1.2.4.3方法绘制洗脱曲线。

1.2.5 三萜纯度与纯化倍数的测定 X-5树脂纯化后的三萜溶液经浓缩、冷冻干燥得三萜粉末。根据公式(8)和(9)计算纯度和纯化倍数。

式(8);

式(9)。

1.2.6 动物分组与处理 小鼠适应性喂养1周,随机分成6组,每组10只(雌雄各半)。东方栓孔菌三萜纯化产物和水飞蓟宾均用蒸馏水配制成悬液。阳性对照组小鼠灌胃150 mg/kg水飞蓟宾,低、中、高试验组分别灌胃100、200和400 mg/kg东方栓孔菌三萜,正常组和模型组灌胃蒸馏水,每天1次,连续20 d。之后正常组灌胃蒸馏水,其余组小鼠灌胃50%乙醇(12 mL/kg),每隔12 h一次,连续3次。

1.2.7 生化指标检测 末次灌胃50%乙醇12 h后,小鼠眼眶采血,在4 ℃下,3000 r/min离心10 min,收集血清,按照试剂盒说明书测定血清中ALT和AST酶活;颈椎脱臼处死小鼠,取肝脏,加适量冷生理盐水,制成10%(m/V)匀浆,按照试剂盒说明书测定肝组织中SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量。

1.3 数据统计分析

实验数据采用SPSS 24.0软件进行分析,结果采用平均值±标准差表示,显著性分析采用Duncan法。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂的筛选

如表2,X-5树脂对东方栓孔菌三萜的静态吸附率和解吸率均大于其它4种树脂,因此选用X-5树脂纯化东方栓孔菌三萜。

表2 五种不同大孔树脂对东方栓孔菌三萜的静态吸附与解吸特性Table 2 Static adsorption and desorption performance of five different macroporous resins on triterpenes from Trametes orientalis

2.2 东方栓孔菌三萜在X-5树脂上的吸附等温线

在25 ℃下,东方栓孔菌三萜在X-5树脂上的吸附等温线如图1所示。

图1 X-5树脂对东方栓孔菌三萜的吸附等温线Fig.1 Adsorption isotherm of X-5 resin on triterpenes from Trametes orientalis

吸附等温线用于描述恒温下吸附剂的平衡吸附量与吸附液的平衡质量浓度之间的关系。将图1中的吸附等温线分别按照Langmuir和Freundlich方程进行非线性拟合,得到两方程的参数(表3)。对比两方程的决定系数,Langmuir方程能更好地描述东方栓孔菌三萜在X-5树脂表面发生的吸附过程,亦说明X-5树脂对东方栓孔菌三萜的吸附以单分子层吸附为主。

表3 X-5树脂吸附东方栓孔菌三萜的Langmuir和Freundlich方程参数Table 3 Parameters correlated by Langmuir and Freundlich adsorption equations of X-5 resin on triterpenes from Trametes orientalis

2.3 动态吸附与解吸

2.3.1 上样质量浓度对吸附穿透曲线的影响 如图2,当上样三萜质量浓度为1.06 g/L时,穿透点(流出液三萜质量浓度为上样三萜质量浓度的1/10)时的上样液体积为8 BV,此时三萜吸附量为274.9 mg/g,而X-5树脂对三萜的吸附达到饱和时的上样液体积为14 BV;当上样质量浓度为2.34 g/L时,穿透点为5 BV,此时三萜吸附量为413.8 mg/g,饱和吸附时的上样液体积为10 BV;当上样质量浓度为3.12 g/L时,其穿透点出现在4 BV,此时三萜吸附量为431.5 mg/g,饱和吸附时为8 BV。由此可见,上样质量浓度越高,穿透点越靠前,穿透曲线越陡峭,达到饱和吸附的时间越短。质量浓度上升至3.12 g/L时,穿透点处的三萜吸附量增幅不大;且溶液较浑浊,易对树脂造成污染和堵塞。故较适宜的上样质量浓度为2.34 g/L。

图2 不同上样质量浓度时X-5树脂的吸附穿透曲线Fig.2 Breakthrough curves of X-5 resin at different loading concentrations

2.3.2 上样流速对吸附穿透曲线的影响 不同上样流速时,东方栓孔菌三萜经X-5树脂的吸附穿透曲线见图3。上样流速分别为1、2和3 BV/h时,东方栓孔菌三萜在X-5树脂上的吸附穿透点分别为7、5和3 BV,穿透点时X-5树脂对东方栓孔菌三萜的吸附量分别为582.9、414.6和229.6 mg/g,达到饱和吸附时的上样液体积分别为15、10和7 BV。由此可知,穿透点处X-5树脂对东方栓孔菌三萜的吸附量随着上样流速的提高而下降。上样流速为1 BV/h时,穿透点时X-5树脂对东方栓孔菌三萜的吸附量最大,但工作周期过长,效率低下;当上样流速为2 BV/h时,穿透点时X-5树脂对东方栓孔菌三萜的吸附量稍低,不过工作效率高于1 BV/h;当上样流速为3 BV/h时,东方栓孔菌三萜上样液还没有被X-5树脂完全吸附就流出,吸附效率低下。综合考虑吸附量与工作效率,上样流速为2 BV/h较适宜。

图3 不同上样流速时X-5树脂的吸附穿透曲线Fig.3 Breakthrough curves of X-5 resin at different loading flow rates

2.3.3 乙醇体积分数对解吸性能的影响 不同乙醇体积分数时,东方栓孔菌三萜经X-5树脂的洗脱曲线见图4。50%、70%和90%的乙醇所对应的东方栓孔菌三萜洗脱率分别为83.25%、91.19%和62.14%。X5树脂所吸附的物质为非极性,洗脱率应随着乙醇体积分数的增加而增大,然而90%乙醇的洗脱率却较低,可能由于随着乙醇体积分数的提高会使一些醇溶性杂质及脂溶性强的杂质洗脱下来,而影响三萜的洗脱。使用70%乙醇洗脱时,洗脱率最高,故在解吸X-5树脂上所吸附的东方栓孔菌三萜时,70%乙醇为较适宜的解吸液。

图4 不同乙醇体积分数时X-5树脂的洗脱曲线Fig.4 Elution curves of X-5 resin at different ethanol concentrations

2.3.4 洗脱流速对解吸性能的影响 由洗脱曲线(图5)可知,洗脱流速为1、2和3 BV/h对应的洗脱率分别为84.55%、91.67%和65.71%。1 BV/h流速时,存在拖尾现象;3 BV/h流速时,洗脱率较低;2 BV/h流速时,洗脱率最高,且无拖尾现象。故在解吸X-5树脂上所吸附的东方栓孔菌三萜时,洗脱流速宜控制在2 BV/h。

图5 不同洗脱流速时X-5树脂的洗脱曲线Fig.5 Elution curves of X-5 resin at different elution flow rates

2.3.5 三萜纯度与纯化倍数测定 在上述优化的工艺条件下,采用X-5树脂纯化东方栓孔菌三萜粗提物,洗脱液浓缩、冻干后得到纯化产物。粗提物与纯化产物的纯度分别为27.58%和83.30%,经X-5树脂纯化后,三萜纯度是纯化前的3倍。

2.4 东方栓孔菌三萜对小鼠酒精性肝损伤的保护作用

2.4.1 东方栓孔菌三萜对血清ALT和AST含量的影响 东方栓孔菌三萜对酒精致肝损伤小鼠血清ALT和AST含量的影响见图6。模型组小鼠血清ALT和AST含量均极显著高于正常组(p<0.01),表明急性酒精摄入造成了小鼠肝细胞的损伤,这亦说明急性酒精性肝损伤小鼠造模成功。东方栓孔菌三萜低、中和高剂量组小鼠血清ALT含量均极显著低于模型组(p<0.01),三萜剂量越高,两种转氨酶含量下降的程度亦越高。阳性对照组小鼠血清ALT和AST含量亦极显著低于模型组(p<0.01)。

图6 东方栓孔菌三萜对酒精致肝损伤小鼠血清ALT和AST含量的影响Fig.6 Effects of triterpenes from Trametes orientalison serum ALT and AST levelsin alcohol-treated mice with liver injury注:##与正常组相比,差异极显著(p<0.01);**与模型组相比,差异极显著(p<0.01);n=10,表4同。

血清ALT和AST含量升高是肝细胞损伤的敏感指标,乙醇代谢过程中产生的活性氧可损害生物膜,导致血清ALT和AST升高[17]。低、中和高剂量东方栓孔菌三萜均能显著拮抗酒精诱导的小鼠血清ALT和AST含量升高,表明东方栓孔菌三萜对酒精致小鼠急性肝损伤具有较好保护作用。

2.4.2 东方栓孔菌三萜对肝组织中抗氧化酶和MDA含量的影响 表4为东方栓孔菌三萜对酒精致急性肝损伤小鼠的肝组织SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量的影响。模型组小鼠肝脏SOD、CAT、GSH-Px活性均极显著低于正常组(p<0.01),MDA含量极显著高于正常组(p<0.01),表明急性酒精摄入造成了小鼠肝脏抗氧化防御系统的损伤,亦进一步说明急性酒精性肝损伤小鼠造模成功。东方栓孔菌三萜低、中、高剂量组小鼠肝脏中SOD、CAT、GSH-Px活性均极显著高于模型组(p<0.01),MDA含量极显著低于模型组(p<0.01)。三萜剂量越高,抗氧化酶上升与MDA下降的程度亦越高。阳性对照亦能极显著提高抗氧化酶活性(p<0.01),降低MDA含量(p<0.01)。

表4 东方栓孔菌三萜对酒精致肝损伤小鼠肝脏SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量的影响Table 4 Effects of triterpenes from Trametes orientalis on liver SOD,CAT,GSH-PX activities and MDA levels in alcohol-treated mice with liver injury

SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶是机体抗氧化防御体系的重要组成部分[18];MDA则是脂质过氧化的主要终产物,可造成机体进一步损伤,MDA含量可反映机体氧化损伤的程度[19-20]。东方栓孔菌三萜能显著提高酒精诱导的小鼠肝脏SOD、CAT和GSH-Px活性,降低MDA含量,表明东方栓孔菌三萜可提高机体抗氧化能力,减少脂质过氧化的发生。结合东方栓孔菌三萜的体外抗氧化活性[11],可初步认为东方栓孔菌三萜可能是通过提高体内抗氧化酶活性、直接清除自由基和螯合金属离子等途径发挥其对急性酒精性肝损伤的保护作用。这与前人研究结果较一致,很多其它来源的三萜类物质也是通过抗氧化途径发挥其对实验性肝损伤的保护作用[21-23]。

3 结论

所选5种供试大孔树脂中,X-5树脂对东方栓孔菌三萜具有较好的静态吸附与解吸性能,东方栓孔菌三萜在X-5树脂表面的吸附符合Langmuir模型,以单分子层吸附为主。动态吸附时,选择2.34 g/L三萜溶液,在2 BV/h流速下上样较为适宜;动态解吸时,选择70%乙醇,在2 BV/h流速下洗脱较为适宜。经X-5树脂纯化后,东方栓孔菌三萜纯度为83.30%,是纯化前的3倍,表明X-5树脂纯化东方栓孔菌三萜效果较佳。

东方栓孔菌三萜能极显著缓解酒精诱导的小鼠血清ALT和AST含量的升高(p<0.01),极显著拮抗酒精所致小鼠肝脏SOD、CAT和GSH-Px活性的下降(p<0.01),极显著降低MDA的生成(p<0.01),表明东方栓孔菌三萜对酒精致小鼠急性肝损伤具有较好保护作用。