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(1.西安悟空检测科技有限公司,陕西西安 710065;2.陕西省产品质量监督检验研究院,陕西西安 710048)

茯砖茶是黑茶的一种,是全发酵茶[1]。齐祖同等[2]人在上世纪九十年代将茯砖茶发酵过程中产生黄色闭囊壳的有益菌鉴定为散囊菌属,细分为冠突散囊菌。因该菌在茯砖的茶渥堆过程中发酵生长,可产生金黄色的闭囊壳,外观呈黄色,被俗称“金花”[3]。该菌在茯砖茶的发酵过程中可产生纤维素酶[4]、吲哚生物碱[5]、阿魏酸酯[6]、消化酶[7]、降脂类物质[8-10]等物质,发花过程中可有效减少茯砖茶中的多酚类物质、氨基酸、黄酮类物质、水溶性蛋白及可溶性糖,这些呈味物质和功能成分含量的变化,对茯砖茶的汤色、气味和口感有很大的改变作用[11-13]。

茯砖茶中散囊菌种类较多[14],菌体活性的高低决定了其生长速率,所以需要根据不同的茶叶品种制定不同的渥堆发酵条件,让冠突散囊菌在茶叶基质中保持良好的活性,进一步增加子囊孢子的产出率,增加“金花”数量,提高茯砖茶品质。陕西作为茯砖茶的发源地,生产工艺久远,而目前的检测过程中,偶有发现“金花”含量不满足标准要求,或者伴有其他杂菌生长的现象,所以对陕西地区茯砖茶中“金花”含量的分布情况检测评价,对工业化生产过程具有一定的指导意义。

本文采购陕西地区市场内50份茯砖茶产品,分别对其中“金花”含量进行检测,并对各试样中菌落形态进行对比,通过结果对陕西地区茯砖茶中“金花”含量进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

茯砖茶,共50份,编号为FZC-1～FZC-50 陕西市场市售;孟加拉红培养基 北京陆桥技术股份有限公司;PDA培养基 北京陆桥技术股份有限公司;冠突散囊菌标准菌株 中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。

MJ-160BSH-Ⅱ霉菌培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司;AESAP1064拍击式均质器 梅里埃诊断产品(上海)有限公司;BHC-1300Ⅱ A2生物安全柜 苏州安泰空气技术有限公司;UPH-3-20T纯水机 四川优普超纯科技有限公司;QL-901涡旋振荡器 其林贝尔仪器制造有限公司;CX41显微镜 奥林巴斯(中国)有限公司;EVOSf1万能荧光数码显微镜 美国AMG公司。

1.2 实验方法

参照GB/T 9833.3-2013《紧压茶 第三部分:茯砖茶》[15]的方法要求,具体方法如下。

1.2.1 取样及制样 取样:a. 茶饼取样[16]:取样器分别于四个角及中心,五个点取样,所取样品混合后,作为检样。b. 袋装或已分解样品:混合均匀后,作为检样。

制样:称取25 g茶叶样品,置于盛有225 mL无菌水的带滤膜均质袋中,用拍击式均质器于5000 r/min拍打2 min。为防止茶叶样品刺破均质袋,可浸泡3 min后再进行拍击混匀。

1.2.2培养及计数 稀释:制样完成后记为10-1稀释液,取1 mL该稀释液注入含有9 mL无菌水的试管中,混合均匀,记为10-2稀释液,依次逐步稀释至10-5。

倾注培养基:孟加拉红培养基于(46±1) ℃水浴保温。选择10-3、10-4及10-5三个稀释液为试样样液,分别吸取1 mL加入无菌培养皿中,每个稀释液做两个平行。将20～25 mL孟加拉红培养基倾注于平皿中,缓缓转种平皿使其混匀。

培养:培养基凝固后,倒置于(28±1) ℃培养5 d,观察菌落计数。

菌落计数:选择适宜计数范围(两个平行平板菌落平均数为10～150 CFU)内平板进行观察,记录各系列稀释度平板上全部“金花”含量,若两个连续的梯度平均菌落数均10～150 CFU之间,按照下列公式计算。并记录杂菌生长情况。

其中,N-样品中菌落数;C-平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;n1-第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;n2-第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;d-稀释因子(第一稀释度)。

1.2.3 菌落形态观察 培养条件同1.2.2,即(28±1) ℃培养5 d,后观察各试样上“金花”的分布情况,对比1～50个试样“金花”菌落的形状、大小、色泽及析出物状态。

1.2.4 菌体形态观察 将冠突散囊菌标准菌株,接种至PDA培养基上,于(28±1) ℃培养5 d,用接种针挑取黄色菌丝体置于滴加无菌水的载玻片上,普通显微镜观察,寻找菌丝体及分生孢子。于(28±1) ℃培养9 d后,用接种针挑取菌落中褐色菌丝体置于滴加无菌水的载玻片上,万能荧光数码显微镜观察,寻找闭囊壳和菌丝体。

1.3 数据处理

每样品采用三个梯度,每个梯度两个平行,同时做样品平行,每个样品共计三梯度四平行。按照15～150 CFU/皿的适宜计数范围,选取平行平板进行计数并分析。将平行样品的不同含量计算,并进行标准误分析。

数据分析软件采用EXCEL 2016,绘图软件采用Origin 2018。

2 结果及分析

2.1 50份茯砖茶样品中“金花”含量

从表1中可以看出,茯砖茶产品中“金花”含量的多少与茯砖茶净含量和保存时间均无直接联系。这也反映出微生物生长的不确定性,生长基质的种类及培养环境条件的变化,才是影响茯砖茶产品中“金花”含量的主因。FZC-1～FZC-48共48份茯砖茶样品中“金花”生长良好,FZC-49和FZC-50中除了“金花”生长外,还存在其他杂霉的生长,故在此不做计数。其中“金花”含量最高的为FZC-35,为350×104CFU/g;含量最低的为FZC-2和FZC-4,均为20×104CFU/g。胡治远等人[14]对湖南地区采集18种不同品种茯砖茶样品检测,其中最高含量为2.8×106CFU/g干茶,最低含量为2.8×104CFU/g干茶。陈然等人[17]对六堡茶中真菌进行检测,真菌总数在102～103CFU/g干茶。可以看出,陕西地区茯砖茶中的“金花”含量略高于其他地区砖茶。

表1 50份茯砖茶样品中“金花”含量检测结果Table 1 Test results of “Golden Flower” in 50 samples

2.2 50份茯砖茶中“金花”含量分布

从图1可以看出,48份可计数茯砖茶中“金花”含量均符合GB/T 9833.3-2013《紧压茶 第三部分:茯砖茶》中对冠突散囊菌含量的要求(20×104CFU/g);44份茯砖茶中“金花”含量符合DBS61/0006-2014 《食品安全地方标准 泾阳茯砖茶》[18]中对冠突散囊菌含量的最低要求(30×104CFU/g)。其中,含量大于200×104CFU/g的样品为11个,小于30×104CFU/g的样品为4个。

图1 50份茯砖茶中“金花”含量分布图Fig.1 Distribution of “Golden Flower” content in 50 samples

2.3 各试样中“金花”菌落形态

从图2中可以看出,各茯茶中“金花”的菌落形态各有差异,在5 d的培养时间后,各菌落的生长速率有所差异。其中FZC-49和FZC-50两种茯茶中有其他杂菌出现。FZC-1～FZC-48为最终计数时各样品的菌落图,可从FZC-1～FZC-48中观察出不同品种茶叶基质上的冠突散囊菌在同一培养基上的菌落形态及数量分布,菌落可呈现亮黄色、暗黄色、褐色或淡黄色。辛乐等人[16]采用孟加拉红培养基对茯砖茶中金花含量进行检测,培养5～6 d后,菌落有褐色出现,边缘黄色。

图2 “金花”形态计数图Fig.2 Colony morphology of “Golden Flower” in 50 samples注:1～50:分别表示FZC-1～FZC-50的菌落分布图。

金花含量的多少影响茯砖茶的品质,而渥堆是茯砖茶生产过程的重要环节,菌落的繁殖在这个过程中发生,需要根据不同的茶叶品种优化不同的渥堆发酵条件,使得冠突散囊菌在茶叶基质中保持良好的活性,迅速繁殖。

图3 冠突散囊菌在PDA上菌落形态Fig.3 Colony morphology of Eurotium cristatum in PDA注:a:PDA上培养5 d;b:PDA上培养9 d。

2.4 冠突散囊菌特征

将冠突散囊菌接种于PDA培养基,置于(28±1) ℃培养5 d后,形状近圆形,较整齐,中心橄榄褐色,有液体渗出,周围培养基变色;9 d后,菌落形态趋于圆形,整齐,中心褐色范围扩大。

“金花”菌繁殖过程分为有性繁殖和无性繁殖,两者伴随产生。培养后期,有性繁殖可产生大量的闭囊壳(图4c),球形,闭囊壳成熟后破裂(图4d),释放出子囊;无性繁殖会产生分生孢子顶囊,连接分生孢子梗及分生孢子,分生孢子呈球状(图4e,图4f)。此结果同彭晓赟等人[19]、陈桂梅等人[20]及谭玉梅等人[21]对冠突散囊菌繁殖过程的增殖方式研究相符,均在培养过程中描述了冠突散囊菌有性繁殖和无性繁殖的状态,闭囊壳和子囊孢子明显。

图4 冠突散囊菌不同繁殖特性Fig.4 Characteristics of Eurotium cristatum注:c:闭囊壳及菌丝;d:闭囊壳释放子囊;e:菌丝体;f:分生孢子头及分生孢子。

3 结论

对陕西省地区50份茯砖茶样品中“金花”含量进行检测,其中有48份茯砖茶样品中“金花”生长良好,生长过程中伴随无性繁殖和有性繁殖阶段,菌落可呈现亮黄色、暗黄色、褐色或淡黄色。“金花”含量最高的为FZC-35,为350×104CFU/g;含量最低的为FZC-2和FZC-4,均为20×104CFU/g。有48份茯砖茶中“金花”含量均符合GB/T 9833.3-2013《紧压茶 第三部分:茯砖茶》中对冠突散囊菌含量的最低要求(20×104CFU/g);44份茯砖茶中“金花”含量符合DBS61/0006-2014《食品安全地方标准 泾阳茯砖茶》中对冠突散囊菌含量的最低要求(30×104CFU/g)。两份茶叶中“金花”含量符和标准要求,但伴有杂菌生长。陕西地区茯砖茶中“金花”含量符和标准要求,对于杂菌情况需要更进一步的把控,确保质量安全。

“金花”作为茯砖茶中的特征菌,其含量决定了茯砖茶的品级。不同茶叶品种基质茯砖茶中的冠突散囊菌在相同培养基上的菌落形态有所差异,选择良好的培养基质是关键。在工业化生长的过程中,使其大量产生子囊孢子的同时,需防止其他杂菌的生长。茯砖茶生产工艺比较成熟,但还应研究不同类型冠突散囊菌的繁殖机理,控制良好的培养条件,进一步增加子囊孢子的产出率。尤其是针对新的茯砖茶培养基质种类的不断增加,深入优化该菌的生长条件更为重要。