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(兰州市食品药品检验所,甘肃兰州 730000)

植物生长调节剂(plant growth regulator,PGR)是人工合成的激素类化合物,属于农药,对农作物的生长起到增产、催熟、增色等作用,但具有一定的毒性[1-3]。近年来,随着科技的发展以及人们对水果的质和量需求的增长,滥用及盲目改变植物生长调节剂的使用剂量常有发生,影响到果蔬的食用安全,由此导致的食品安全问题备受关注[3-4,15-17]。

国内现有的检验标准只有针对单一生长调节剂的且主要对象为出口食品,国内外已有研究多种生长调节剂的气相色谱法、液相色谱法、酶联免疫法、气质联用法、液质联用法[3,5-14],其中液相色谱-质谱法为热点方法,解决了杂质的干扰、灵敏度低等问题,但针对生长调节剂使用较频繁的浆果、瓜果类的专属检测方法未见报道。

本实验前期进行了田间及农药使用的实地考察,将葡萄、草莓、西瓜等水果中使用的PGR范围缩减为矮壮素、缩节胺(甲哌鎓)、脱落酸(S-诱抗素)、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、噻苯隆、胺鲜酯(DA-6)、吲哚乙酸、赤霉素、5-硝基愈创木酚、氯吡脲、吲哚丁酸、1-萘乙酸(1-萘乙酸钠)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、4-氯苯氧乙酸、芸苔素内酯(油菜素内酯)、四烯雌酮、多效唑、烯效唑、调节膦(安果),针对以上生长调节剂,本文详细对其前处理、仪器方法等进行了研究,选用HPLC-MS/MS建立了测定方法,旨在为生长调节剂的标准建立提供理论基础,为生长调节剂的应急检测及风险监测提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

吲哚乙酸、吲哚丁酸、1-萘乙酸、6-苄基腺嘌呤(6-BA)、四烯雌酮、氯吡脲、多效唑、矮壮素、烯效唑、噻苯隆、调节膦、缩节胺/甲哌鎓、5-硝基愈创木酚钠、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、赤霉素、4-氯苯氧乙酸 来源为Dr.Ehrenstorfer.Gmbh;脱落酸、芸苔素内酯/油菜素内酯 上海安谱科技有限公司;胺鲜酯 北京曼哈格,以上对照品纯度均大于96%;甲醇、乙腈、甲酸、乙酸 均为色谱纯,德国Merck公司;乙酸铵 HPLC级,美国Sigma公司;封端十八烷基(C18)粉末、N-丙基乙二胺(PSA)粉末、石墨化炭黑(GCB)粉末、增强基质去除(EMR)粉末 美国Agilent公司;无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸氢二钠、柠檬酸钠 国药集团化学试剂有限公司;超纯水 由超纯水系统制备。

6460三重四级杆液质联用仪,配有1260HPLC 美国Agilent公司;5810R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司;Milli Q超纯水系统 美国Millipore公司;B-400均质仪 美国BUCHI公司;EVA50A氮吹仪 普立泰科公司;MS3 涡旋混匀器 美国IKA公司;十万分之一、万分之一电子天平 德国Sartorius公司;KS 501振荡器 美国IKA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 提取:准确称取粉碎均匀的样品5 g,加入10.0 mL 1%乙酸乙腈溶液,振荡(300 Mot/min)15 min,以提高提取率,然后加入脱水试剂(含4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸氢二钠、0. 5g柠檬酸钠),立即涡旋混合1 min,在4 ℃、4000 r/min离心5 min,使得乙腈和水相完全分离。取5.0 mL上清液用于净化。

净化:加入装有填料的净化管中,涡旋振荡2 min,于4 ℃、10000 r/min离心5 min,取上清液2.0 mL氮吹至净干,用50%的甲醇水溶液复溶至1.0 mL后,过0.2 μm滤膜过滤后,上机测定。对比净化填料的不同组成及配比,以各目标物的回收率为评价指标,净化填料组成及配比的方案见表1。

表1 净化填料的组成及配比Table 1 Composition and proportion of purifying filler

1.2.2 液相色谱条件 液相色谱的流动相比较了a. 乙腈-水、b.乙腈-0.1%甲酸水溶液、c.乙腈-5 mmol乙酸铵溶液三种组成,通过各目标物色谱峰面积大小确定最佳流动相组成。

色谱柱:Waters Acquity HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)。流动相A:0.1%甲酸水,流动相B:乙腈;梯度洗脱程序如下表2。流速:0.2 mL/min;柱温:35 ℃;进样量:5 μL。

表2 流动相梯度条件Table 2 Gradient elution condition for liquid phase

1.2.3 液相色谱-串联质谱条件 采用浓度0.1～0.5 μg/mL的目标物单元素标准溶液进行质谱条件的确定,分别通过自动软件优化、手动优化两种方法。

液相色谱-串联质谱条件:ESI源,多反应监测模式(MRM),喷嘴电压:30 psi,干燥气温度:350 ℃,干燥气流速:13 L/min,毛细管电压:4000 V。各生长调节剂的定量和定性离子、碰撞能量和碎裂电压参数见表3。

表3 生长调节剂的质谱条件Table 3 Mass spectrometric parameters of the growth regulators

1.2.4 方法学验证 用空白葡萄基质配制混合标准溶液系列,以化合物浓度为横坐标,色谱峰面积为纵坐标做标准曲线。将标准曲线最低浓度的混标溶液取1.0 mL,加入阴性葡萄样品中,按1.2.1方法进行加标实验,得到目标化合物的浓度与3倍信噪比(S/N)比较,调整各目标化合物的加标量,得到各目标物响应为3倍信噪比(S/N)时对应的样品浓度,由此得到各目标物的方法检出限,以目标化合物响应为10倍信噪比(S/N)时对应的样品浓度计算各化合物的定量限。

分别取葡萄、草莓、西瓜的空白基质,添加40.0、100.0、200.0 μg/kg三个水平的19种生长调节剂混合标准溶液,批内6次平行,按1.2.1方法进行添加回收实验。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

采用19种生长调节剂的单元素标准溶液(浓度低会影响碎片离子的判断)进行质谱条件的确定,分别通过自动软件优化、手动优化两种方法。实验得出:使用软件自动优化时,缩节胺、4-氯苯氧乙酸、2,4-D仅有1对碎片离子,手动优化可找到定性离子;1-萘乙酸(钠)仅有1对碎片离子。其次,6-BA、噻苯隆、氯吡脲、吲哚乙酸、吲哚丁酸、脱落酸在正、负离子模式下均有响应,但是在正离子模式下丰度明显较高,因此赤霉素、2,4-D、5-硝基愈创木酚、4-氯苯氧乙酸为负离子模式,其它目标物均为正离子模式。

2.2 液相色谱条件优化

2.2.1 流动相的选择 流动相比较了:a.乙腈-水、b.乙腈-0.1%甲酸水溶液、c.乙腈-5 mmol乙酸铵溶液,当流动相为b、c时,二者对各目标物的峰形及响应影响不大,优选不含盐的弱洗脱相0.1%甲酸水溶液。比较a、c两种流动相,对目标物的峰形、分离度没有影响;对保留时间有较小的影响:a条件下矮壮素、缩节胺、6-BA、胺鲜酯保留时间延后;对各目标物的响应(以峰面积表示)影响较大,a、b条件下各生长调节剂的峰面积对比见图1(取5次测定的平均值为结果)。由图1可知,水作为弱洗脱相时,赤霉素、2,4-D、4-氯苯氧乙酸、油菜素内酯无响应;吲哚丁酸、调节膦的响应不受影响,其它目标物的响应均在水作为弱洗脱相时较高,且5-硝基创愈木酚在乙腈-水条件下的响应较乙腈-0.1%甲酸水溶液条件下高25倍。除赤霉素、2,4-D、4-氯苯氧乙酸(均为负离子模式),其它16种生长调节剂在流动相(水和乙腈)下响应较高。综合考虑,19种生长调节剂的流动相为:0.1%甲酸水溶液和乙腈。

图1 不同流动相组成对生长调节剂峰面积的影响Fig.1 Effects of different mobile phase compositions on growth regulator peak area

2.2.2 流动相梯度条件的确定 色谱柱及流动相的梯度条件对多目标组分的分离有较大影响。本文比较了Waters Acquity HSS T3色谱柱、Agilent Eclipse Plus C8 RRHD色谱柱、Agilent XDB-C18色谱柱,在Waters Acquity HSS T3色谱柱条件下,目标物的分离度、峰形和灵敏度都较好。试验发现,流动相起始的比例对目标物的分离有较大的影响,图2为三种梯度条件下19种生长调节剂的总离子流图。由图2可知,A(起始比例为0.1%甲酸水97%)和B(起始比例为乙腈90%)条件下,所有目标物出峰时间重叠,影响峰形,且无法分段采集,导致目标物响应降低。当水相起始比例为30%时,各化合物在11 min内依次分离(见图2中C)。泵压在17 min时达到平衡。因此,本实验色谱柱确定为Waters Acquity HSS T3(2.1×100 mm,1.8 μm),流动相的梯度条件如表2所示。19种植物生长调节剂混合标准溶液的MRM色谱图见图3。

图3 19种生长调节剂的MRM色谱图Fig.3 MRM chromatograms of the 19 plant growth regulators

图2 不同梯度条件的流动相对生长调节剂出峰的影响Fig.2 Effects of that gradient condition on the peak of the growth regulator注:图A～C流动相起始比例分别为：0.1甲酸水∶乙腈=97%∶3%、90%∶10%、70%∶30%。

2.3 标准溶液稀释溶剂的确定

对照品均易溶于甲醇,用甲醇配制一级储备液(1 mg/mL)。混合标准溶液的配制溶剂对目标物出峰有影响。比较不同(甲醇+水)溶液的浓度:100%、70%、50%、20%、0%,对各目标物响应的影响见图4。由图4可知,调节膦在甲醇+水浓度为50%～20%时响应较好,使用100%甲醇在色谱柱中不保留,无响应;胺鲜酯、脱落酸受配制溶液浓度的影响较大,随着甲醇-水溶液浓度降低,响应降低;赤霉素在70%的甲醇+水溶液中的响应较50%的小;其它生长调节剂的响应受配制溶液浓度的影响较小。综合考虑,当甲醇+水的比例为50%时,各化合物均能保证较好的响应值,因此选择50%的甲醇+水为对照溶液及样品上机前的复溶溶液。

图4 不同浓度的标准溶液稀释溶剂对19种生长调节剂峰面积的影响Fig.4 Effects of different concentrations of standard solution on the peak area of 19 growth regulators

2.4 样品提取溶剂的优化

乙腈极性大,对农药残留的提取有较好的效果,且考虑到甲醇的危害性,所以提取溶剂以乙腈为主,在其他前处理条件不变的方法下,选取不同的提取溶剂:乙腈、70%乙腈水溶液、1%乙酸乙腈、1%甲酸乙腈,通过比较回收率确定样品的提取溶剂。19种生长调节剂在不同提取溶剂的回收率对比见图5。由图5可知,乙腈或1%乙酸乙腈提取效果较好,均在70%～110%之间,而70%乙腈水溶液、1%甲酸乙腈对多组分的提取效果不均衡,吲哚乙酸、吲哚丁酸、赤霉素、2,4-D、4-氯苯氧乙酸的回收率较低;乙腈和1%乙酸乙腈提取条件下的平均回收率分别为81.3%和87.0%,综合考虑选用1%乙酸乙腈为提取溶剂。因为酸性条件抑制了植物生长调节剂中羧酸的电离,从而增加其在乙腈中的溶解度[18]。浆果类、瓜果类水果的水分含量为85%～90%,用1%乙酸乙腈提取时,形成酸化乙腈水的体系,对不同极性的目标物有较好的提取率。因此,本实验选择用1%乙酸乙腈为提取溶剂。

图5 不同提取溶剂对19种生长调节剂回收率的影响Fig.5 Effects of different solvent on recovery of 19 growth regulators

2.5 净化条件的优化

蔬菜水果中的农药残留净化过程主要使用PSA、GCB、C18、EMR。本试验选取了以上5种方案(表1),通过回收率确定净化的填料及配比,5种净化方案对生长调节剂回收率的影响见图6。PSA可去除样品中的有机酸、糖等干扰物,对4-氯苯氧乙酸、2,4-D有一定的吸附,但与PSA的使用量有关,方案3、4中PSA仅为100 mg,由图6可知,对目标物的回收率影响不大。C18在方案1、2中为150 mg,此使用量对6-BA、矮壮素的回收率有降低的影响;当GCB的使用量从15 mg升至30 mg时,对6-BA、矮壮素的回收率有降低的影响。19种生长调节剂回收率在70%～110%之间的为方案3,且方案3去除浆果类的花色苷效果最佳,因此选方案3为本实验的净化填料及配比。

图6 不同净化条件对19种生长调节剂回收率的影响Fig.6 Effects of different purification conditions on recovery rate of 19 growth regulators

2.6 基质效应、线性范围、检出限及定量限

不同的样品基质对目标物的响应值会有增强或抑制的作用,为基质效应。本试验分别比较了葡萄、草莓、西瓜的空白基质配制的混合标准溶液和50%甲醇水溶液配制的混合标准溶液,通过基质标样的响应值/纯溶剂标样的响应值,得到78%的目标物的基质效应值小于1,即表现为基质抑制作用。因此使用空白样品基质配制混合标准系列溶液。

用空白葡萄基质配制混合标准溶液的系列,以浓度为横坐标,色谱峰峰面积为纵坐标,进行一次线性回归计算,标准曲线的相关系数(r)均大于0.9902。由1.2.4方法得到方法检出限和定量限,检出限为0.09～16.8 μg/kg,定量限为0.27～50.4 μg/kg,具体见表4。

表4 19种生长调节剂的标准曲线、线性范围、检出限及定量限Table 4 Standard curves,correlation coefficients,LODs and LOQs for 19 growth regulators

2.7 不同基质的回收率和精密度

分别取葡萄、草莓、西瓜的空白基质,添加低、中、高三个水平的19种生长调节剂混合标准溶液,进行前处理,测定回收率,每个水平均测定6次,计算RSD,结果见表5,19种生长调节剂的回收率为69.4%～106.2%,RSD为1.1%～12.5%。

表5 不同基质中19种生长调节剂的回收率和相对标准偏差(n=6)Table 5 Average recoveries and RSDs of 19 growth regulators in diffient matrix(n=6)

续表

2.8 实际样品的测定结果

随机购买市售浆果类、瓜果类水果200种,检出率为6.3%,其中葡萄、樱桃、草莓、猕猴桃中的分别检出矮壮素、氯吡脲、赤霉素、5-硝基愈创木酚钠、脱落酸,最大浓度分别为30.45±0.11、1.22±0.01、18.41±0.04、2.03±0.01、8.97±0.02 μg/kg,西瓜、香瓜中仅在西瓜中检出氯吡脲,浓度为(2.86±0.01) μg/kg，其中检出胺鲜酯的样品和空白样品的总离子流图见图7。对于果蔬类中残留的生长调节剂对人体的危害需进一步通过实验验证。

图7 检出胺鲜酯的样品和空白样品的总离子流图Fig.7 Total ion flow diagrams of samples and blank samples were obtained

3 结论

本实验建立了同时测定浆果类、瓜果类水果中19种植物生长调节剂的高效液相色谱-串联质谱检测方法。样品采用含1%乙酸的乙腈提取,无水硫酸镁-石墨化炭黑(GCB)-(PSA)分散固相萃取净化。液相色谱采用Waters Acquity HSS T3色谱柱,乙腈和 0.1%甲酸水溶液作流动相进行梯度洗脱。质谱分析采用电喷雾多反应监测模式,以基质匹配标准曲线外标法定量。19种植物生长调节剂在各自浓度范围内线性良好,线性相关系数(r)均大于 0.9902,检出限为0.09～16.8 μg/kg,定量限为0.27～50.4 μg/kg。以葡萄、草莓、西瓜为代表性基质进行三水平加标回收实验,回收率为69.4%～106.2%,相对标准偏差(RSD)在1.1%～12.5%之间。本方法简便快速,灵敏度和准确性高,应用于日常检测可以缩短检测周期,降低检测成本,对植物生长调节剂残留检测具有重要意义。