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(北京工商大学食品学院,北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京 100048)

有关西瓜汁风味的萃取,何聪聪等[9-10]通过不同的萃取方法对西瓜汁香气成分进行分析和比较,结果表明,顶空法中的固相微萃取法(SPME)和溶剂法中的溶剂辅助蒸发法(SAFE)是最合适西瓜汁风味萃取的两种方法,同时验证西瓜汁中的关键香气成分,包括反-2-壬烯醛、反,顺-2,6-壬二烯醛、顺-6-壬烯醛、壬醛、己醛、顺-6-壬烯醇、顺,顺-3,6-壬二烯醇等。其中固相微萃取(SPME),主要依据不同极性涂层的吸附特性将挥发性化合物富集在萃取头上,具有操作简便、敏感、样品用量少、重现性好等优点,但是萃取物的组分易受萃取头极性的影响;SAFE在低温、高真空的条件下,更能得到真正可靠的风味提取物,最接近原样品的香气轮廓,能够对中等或低挥发性组分进行高效提取[11-12]。

关于气味化合物对整体风味的贡献的判定,常见用芳香萃取物稀释分析(Aroma extract dilution analysis,AEDA)来确定具有重要贡献的关键性风味物质[13]。它以人的鼻子作为检测器进行嗅闻,将溶剂按照一定比例依次稀释样品,直至嗅闻不到该气味为止。在这种方法中,气味化合物的气味强度由气味稀释因子(Flavor dilution factor,FD因子)来表示,FD因子为将原样品中的各种气味化合物稀释至刚嗅闻不到时所用的最小稀释倍数。一般来说,FD因子越大,该化合物的贡献程度越大。对于固相微萃取这种顶空萃取稀释的方法,可称作动态顶空稀释分析(Dynamic headspace dilution analysis,DHDA),常采用增大进样口分流比的方式达到稀释目的,FD因子即气味刚嗅闻不到所用的分流比与气相色谱最初分流比的比值[14]。

目前已有众多学者对西瓜汁风味进行了研究。西瓜汁中已发现约300种挥发性化合物,以醛类、醇类、酯类和羰基化合物最多[15],其中不饱和C9醛和醇是构成西瓜汁香气活性化合物最重要的挥发性成分[16]。而从异味角度关于西瓜汁风味的研究,以及热处理西瓜汁导致的“热异味”的问题,国内外很少报道。

因此,结合目前西瓜汁现状,研究西瓜汁热处理过程中的关键异味物质是解决“热异味”的关键所在。本文通过固相微萃取法(SPME)和溶剂辅助蒸发法(SAFE)对西瓜汁中风味物质进行萃取,结合气相色谱-嗅闻-质谱技术(GC-O-MS)对热加工西瓜汁的关键异味成分进行分析,以期为西瓜汁热加工提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

麒麟西瓜 购于北京市永辉超市;2-甲基-3-庚酮,气味化合物标品 色谱纯,美国Sigma公司;正己烷 色谱纯,美国Fisher公司;六种关键气味化合物的标品 色谱纯,美国Sigma公司;无水乙醚、正戊烷 分析纯,北京化学试剂公司;系列烷烃(C7～C30) 色谱纯,北京化学试剂公司;氢氧化钠,氯化钠,碳酸钠 分析纯,西陇科学股份有限公司;盐酸 分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

真空封口机 深圳市叶通明达科技有限公司;7890A-7000B气质联用仪(配有EI离子源和NIST 08数据库) 美国Agilent公司;Sniffer 9000型嗅闻仪 瑞士Brechbuhler公司;DB-WAX毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm) 美国J&W公司;HH-1超级恒温水浴锅 金坛市至翔科教仪器厂;40 mL顶空瓶 德国Gerstel公司;榨汁机HP1858 飞利浦公司;手动固相微萃取进样器、50/30 μm DVB-CAR-PDMS 美国Supelco公司;TH7-C-1全温振荡器 常州华普达教学仪器有限公司;分液漏斗 北京玻璃仪器厂;Vigreux柱(50 cm×内径1 cm) 北京博美玻璃仪器有限公司;氮吹仪 天津恒奥科技发展有限公司;溶剂辅助风味蒸发装置 Glasbläserei Bahr,Manching,Germany。

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1.2 实验方法

1.2.1 西瓜汁的制备 西瓜经清洗后取瓤,用榨汁机破碎,经纱布过滤后,迅速移至保鲜袋中封口,袋装样品放置液氮中迅速冷冻后，放置于-80 ℃冰箱冷冻备用。

1.2.1.1 鲜榨组西瓜汁 袋装冷冻的样品分别在常温下进行解冻,之后可进行鲜榨组西瓜汁的风味提取及分析。

1.2.1.2 热加工组西瓜汁 袋装冷冻的样品分别经解冻后,在70 ℃水浴条件下加热20 min,冷却室温后即可对该热加工组西瓜汁风味进行提取分析[17]。

1.2.2 气味感官评价 鲜榨组与热加工组西瓜汁各取10 mL放置顶空瓶中,感官评价在放置在无噪音干净且无异味的房间中进行,为了避免个体差异,12名(7名女性,5名男性,平均年龄30岁左右)感官评价员严格按照表1感官评价标准依次对各气味特征进行打分[18];总分采用5分制原则,0分代表没有该气味;3分代表该气味强度为中等;5分代表该气味极强,综合取平均值,将其结果绘制成雷达图。

1.2.3 风味化合物的提取 本文西瓜汁风味化合物提取的操作参考何聪聪等人[12]对西瓜汁的萃取方法。

1.2.3.1 固相微萃取法(SPME) 取西瓜汁10 mL于顶空瓶中,同时加入内标物2-甲基-3-庚酮1 μL加盖密封，使其在水浴锅中平衡20 min后,用SPME萃取头吸附40 min,其中水浴锅温度稳定维持在40 ℃左右。待其萃取完全后,插入GC进样口,萃取头在250 ℃高温条件下解析5 min。鲜榨组和热加工组西瓜汁每组样品重复三次。

1.2.3.2 溶剂辅助风味蒸发法(SAFE) 取西瓜汁样品100 mL,有机溶剂乙醚与正戊烷分别(2∶1)100 mL和50 mL,内标物2-甲基-3-庚酮50 μL于密闭塑料瓶中,振荡器处理8 h左右,静置待其分层后,用分液漏斗取上层有机相。SAFE装置的安装一定要保持水平,恒温水浴锅温度为40 ℃,1000 mL圆底烧瓶作为废液瓶固定在装置左侧,将另一250 mL圆底烧瓶作为样品接收瓶置于液氮环境中,冷阱中也充满液氮。SAFE的进出口连接循环水浴箱,温度保持在50 ℃,整个装置的真空度稳定在10-4Pa。将有机层放入样品瓶中,为维持真空度,每次样品的添加量必须少量且操作迅速。最后所收集样品按照中碱性、酸性成分依次分开[19],再分别经过无水Na2SO4除水,微格柱浓缩以及氮吹浓缩,使得最终样品浓缩至1 mL左右。鲜榨组和热加工组西瓜汁每组样品重复三次。

1.2.4 GC-O-MS分析条件

1.2.4.1 气相色谱(GC)条件 样品经过进样口高温气化后,根据各成分与GC柱子的分配比不同得到分离,分别进入MS检测器和嗅闻检测器。GC条件:DB-WAX极性毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),溶剂延迟时间为4 min,程序升温:初始温度,40 ℃,保持5 min,以5 ℃/min升温到200 ℃,保持0 min,再以8 ℃/min升温到230 ℃,保持3 min,流程总运行时间为41 min。氦气作为载气,流速为1.2 mL/min,初始分流比10∶1。

1.2.4.2 质谱(MS)条件 EI离子源,电子能量70 eV,传输线温度280 ℃,离子源温度为230 ℃,四极杆温度为150 ℃,质量扫描范围m/z 50～500。

1.2.4.3 嗅闻检测器条件 嗅闻仪接口温度为220 ℃,其中接口处连接超纯水,以保持实验人员吸入湿润的气体从而使鼻粘膜得到保护。实验人员在嗅闻口进行嗅闻的同时,依次记录闻到的各气味开始出现的时间,气味特征和气味强度。

1.2.5 定性与定量方法

1.2.5.1 化合物的定性 化合物由质谱数据库[20]和文献报道[21]的保留指数RI值和MS图及芳香特性来鉴定。根据饱和系列正构烷烃的出峰时间利用如下公式,进行未知物出峰时间RT与RI值之间的换算,将所得的RI值与相关文献进行比较,从而进一步确定化合物。

式中:ta为样品中化合物a的保留时间;tn为正构烷烃Cn的保留时间(样品a的保留时间应在正构烷烃Cn和C(n+1)之间)。

1.2.5.2 化合物的定量 以浓度为0.816 μg/μL的2-甲基-3-庚酮为内标物,采取内标半定量方法做定量分析[22],即通过内标物的浓度和峰面积与未知物的峰面积按照如下公式计算:

式中:AI、AX、CI、CX分别为内标物的峰面积、未知物的峰面积、内标物的浓度、未知物的浓度。

1.2.6 关键异味成分的鉴定 将热加工组西瓜汁分别以SPME和SAFE两种方法结合嗅闻做稀释分析,其中稀释比例为3n(n=1,2,3…)。对于SPME进样分析方法,初始分流比为10∶1,每次进样依次增加分流比即30∶1、90∶1、270∶1等,直至嗅闻不到任何气味为止,对应的FD因子依次为3、9、27等[14];对于SAFE方法的稀释分析,即将SAFE得到的浓缩液依次用乙醚和正戊烷按3n比例进行AEDA稀释,进样分析结合嗅闻,直至嗅闻不到任何气味为止，分别计算两种方法下每种气味化合物的FD因子。每组样品平行三次。

1.2.7 重组验证实验 西瓜汁重组基质含10 mL超纯水,并用柠檬酸、葡萄糖调整最终基质糖度维持在8±0.06 Brix左右,pH在5.7±0.1左右[10],以接近真实基质。将以上初步得出的关键气味化合物的标品按照所求浓度进行模型构建,并与真实热加工西瓜汁进行感官评价。

1.2.8 数据分析 表格与雷达图制作由Microsoft Office Excel 2010软件完成,采用SPSS Statistics 17.0 软件对其进行单因素方差分析及显著性分析,显著性分析采用Duncan检验。

2 结果与分析

2.1 气味感官评价

从感官评价的结果来看,鲜榨组西瓜汁以黄瓜味、青草味、果香味等清新气味为主;热加工西瓜汁则以蒸煮味,脂肪味等令人不愉悦的气味为主,其中以蒸煮味最为强烈。但是后期对挥发性风味物质的鉴定,并未检索到与蒸煮味、脂肪味直接有关的物质,所以加热后该不愉快气味的产生应该是多种物质综合作用的的结果。

图1 加热组与鲜榨组的气味感官评价雷达图Fig.1 Sensory evaluation radar diagram of heating group and fresh pressing group

2.2 GC-O-MS分析及讨论

利用SPME和SAFE两种方法结合,分别萃取鲜榨组与热加工组西瓜汁的挥发性风味物质,将总离子流图的出峰结果与质谱库匹配,最终确定西瓜中挥发性化合物以及各嗅闻到的挥发性化合物的稀释倍数,并依据鲜榨与热加工西瓜汁挥发性成分的浓度做显著性分析。

从表2和表3数据结果可以看出,加热前后西瓜汁的风味化合物皆以醛类、醇类和酮类为主。用SPME检测出33种风味物质,其中醛类18种,醇类10种,酮类4种;而SAFE检测出22种风味物质,其中醛类4种,醇类6种,酮类3种,即SPME检测出的化合物多于SAFE,但是含硫化合物只有SAFE法检出。从嗅闻结果来看,SPME嗅闻到的化合物有10种,SAFE嗅闻到的化合物仅有4种,大多数化合物因其浓度过低或阈值过高而无法被实验人员嗅闻到。综合比较SPME和SAFE两种方法的差异,SPME检测出的化合物多于SAFE,可能与SAFE浓缩操作中低沸点高挥发风味物质的损失有关,也可能是不稳定的风味物质与有机溶剂在混匀过程中发生了化学反应[23]。对于含硫化合物只有SAFE检测出,可能与SPME的纤维涂层的吸附特性有关[23]。因此西瓜汁的风味化合物要SPME和SAFE两种方法结合才能达到全面萃取。

表2 西瓜SPME中挥发性成分及稀释结果Table 2 Volatile compounds in SPME of watermelon and dilution results

表3 西瓜SAFE中挥发性成分及稀释结果Table 3 Volatile compounds in SAFE of watermelon and dilution analysis results

根据FD稀释因子结合嗅闻结果,初步判断热加工西瓜汁中反,反-2,4-庚二烯醛(脂肪,坚果味)、反,顺-2,6-壬二烯醛(黄瓜,清新味)、1-壬醇(脂肪,清香味)、(E,Z)-2,6-壬二烯-1-醇(黄瓜味)、香叶基丙酮(花香,甜味)、(Z)-β-紫罗酮(花香,燕麦味)是可能的关键香气成分,这与何聪聪等[12]研究结果相似。

因为热加工西瓜汁的蒸煮等不愉快气味是多种物质综合作用的结果,通过加热前后浓度的对比,西瓜汁中以下物质经加热后含量明显增加:反-2-戊烯醛(草莓,水果香)、(Z)-β-紫罗酮(花香,燕麦味)、反-2-庚烯醛(肥皂,苦杏仁)、反-2-辛烯醛(脂肪,咖啡味)、癸醛(肥皂,刺激味)、正辛醇(金属,烧焦气味)、己醛(青草味)、二乙基二硫醚(大蒜,刺鼻味)、己醇(花香,苦味)、1-壬醇(脂肪,清香味)、二丙基二硫醚(洋葱,硫醚味),结合气味特征,其中反-2-庚烯醛(肥皂,苦杏仁)、反-2-辛烯醛(脂肪,咖啡味)、癸醛(肥皂,刺激味)、正辛醇(金属,烧焦气味)、二乙基二硫醚(大蒜,刺鼻味)、己醇(花香,苦味)、二丙基二硫醚(洋葱,硫醚味)对整体异味的产生影响较其他含量显著增加的香气成分贡献大。

因此热加工西瓜汁中FD因子较大且加热后含量显著增加,同时其气味特征表现令人不悦的风味物质都可能是整体异味的来源,综合作用生成令人不愉快气味。根据FD因子的排序,按照异味贡献强度及气味特征[24],初步判断热加工西瓜汁的关键异味化合物如下:反-2-庚烯醛(肥皂,苦杏仁)FD>81、反-2-辛烯醛(脂肪,苦咖啡味)FD>81、己醇(花香,苦味)FD=81、二丙基二硫醚(洋葱,硫醚味)FD=81、癸醛(肥皂,刺激味)FD=81、正辛醇(金属,烧焦气味)FD=27。

2.3 重组验证结果分析

将以上初步得出的六种关键异味化合物的标准品按照定量浓度复配到西瓜汁基质的,为了真实还原西瓜汁风味,同时加入上述六中西瓜汁关键香气物质标准品。感官评价标准同1.2.2气味感官评价,雷达图结果如图4所示。

图4 重组西瓜汁与加热组的气味感官评价雷达图Fig.4 Sensory evaluation radar diagram of recombination and thermal treatment watermelon juice

因重组后各个气味特征平均打分较低，所以雷达图中最大分值以3分呈现。由图4可看出，气味特征相似度最高的是花香味、果香味；重组西瓜汁与加热西瓜汁相比，黄瓜味、青草味的气味特征分值升高，蒸煮味、脂肪味这些不愉快气味较真实体系降低，清香味也略有降低。图4中八个香气特征在重组和热加工西瓜汁中均不存在显著差异(p<0.05)，整体气味特征基本一致，表明热加工重组模型构建成功，基本验证了以上六种异味化合物能近似代表热加工西瓜汁的整体异味。因此可初步认为反-2-庚烯醛、反-2-辛烯醛、己醇、二丙基二硫醚、癸醛、正辛醇为关键异味物质。

3 结论

采用SPME和SAFE两种方法分别对鲜榨和热加工西瓜汁的风味物质进行尽可能全面地萃取。鲜榨西瓜汁以黄瓜、青草、果香等清香型为主,而热加工西瓜汁以蒸煮、脂肪等令人不悦的异味为主。利用GC-O-MS仪器,从异味的角度对热加工西瓜汁风味成分进行研究,结合重组实验的验证,初步判断热加工西瓜汁的关键异味化合物包括如下:反-2-庚烯醛(肥皂,苦杏仁)、反-2-辛烯醛(脂肪,咖啡味)、己醇(花香,苦味)、二丙基二硫醚(洋葱,硫醚味)、癸醛(肥皂,刺激味)、正辛醇(金属,烧焦气味)。