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(1.西华大学食品与生物工程学院,四川成都 610039;2.宜宾学院生命科学与食品工程学院,四川宜宾 644000)

葛根是豆科葛属植物的根,其营养丰富,富含淀粉、氨基酸、膳食纤维,且含葛根素、大豆苷、大豆苷元等黄酮类物质,具有心血管保护[1-2]、神经保护[2]、预防骨质疏松[3]、降低胆固醇[4]、肝肾保护[5-6]等药理作用和保健功能。目前,对葛根综合利用主要集中在葛根黄酮成分药理作用研究[1-3]、葛根酵素[7]、葛根复合饮料[8]、葛根全粉[9]等方面。葛根酒研发多以与糯米等其他原料混合制得的葛根黄酒,单独以葛根为原料发酵低度酒的研究相对较少。

如张丽杰等[10]利用响应面法对α-淀粉酶、糖化酶、酵母添加量三个因素进行了优化,得到了酒精体积分数6.37%、总黄酮溶出量28.66 mg/mL的葛根酒;孙国术等[11]采用微波进行葛根糊化处理,研究α-淀粉酶、糖化酶、酵母添加量以及发酵时间对酒精度、葛根素含量和感官品质的影响,以响应面法确定制备工艺,获得酒精体积分数为7.47%、葛根素含量为30.45 mg/100 g的葛根酒;蒋鹏飞[12]分别利用四种酵母对鲜葛根酶解液进行发酵陈酿后,对其香气成分进行分析,其中KIM酵母检测出香气种类最多,浓度最高,并且得到乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸、癸酸、己酸、辛酸、异戊醇、苯乙醇、4-乙基苯酚和2,4-二叔丁基苯酚是构成葛根陈酿酒典型香气的重要成分。

感官评估是接受或拒绝食物的最终标准,食物的感官质量可以通过估计食物在消费者心中产生的总体印象来评估,具有不准确、不确定的重复性特点[13]。传统的食品感官评价法,由于评价人员的主观因素的影响,会对结果造成较大的误差[14]。模糊综合评判是利用模糊数学的一些概念,将一些边界不清、不易定量的因素定量化、综合评价的一种方法[15]。在模糊建模中,通过因素集、评价集和权重之间的关系,运用模糊关系合成原理可以得出关于食品接受度的结论,从一定程度上改变了评价结果的客观性。因此广泛被用于对啤酒[15]、柑橘酒[16]、香肠[17]、茶[18]和乳制品[13]等食品的感官评价中。

本实验以葛根为原料,经过淀粉的液化、糖化后,采用模糊数学综合评价结合响应面试验对发酵工艺进行优化,得到具有葛根的清香、酒体澄清透明、风味独特、营养丰富的养生酒,并对发酵成品的香气成分进行检测分析,旨在为葛根发酵酒提供理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜葛根 宜宾好葛农产品公司,切丁,60 ℃烘干,在高速粉碎机中粉碎后过40目筛,备用;α-淀粉酶(4000 U/g)、糖化酶(100000 U/g) 购自上海源叶生物科技有限公司;Lalvin EC1118酵母 法国莱蒙特公司;2-辛醇(色谱级) 成都市科隆化学品有限公司;其余试剂 均为国产分析纯。

7890A/5975C型气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦科技有限公司;固相微萃取装置(手动进样器和50 μm DVB/CAR/PDMS萃取头) 美国Supelco公司;2500A高速粉碎机 永康速泽工贸有限公司;HH.WH.600S恒温水浴锅 上海跃进医疗器械有限公司;GHP-9160隔水式恒温培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司;MLS-3781L-PC高压灭菌锅 日本松下健康医疗器械株式会社;ME204电子天平 梅特勒-托利多(上海)有限公司;PHSJ-5酸度计 上海雷磁新泾仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酵母的活化 称取一定量的Lalvin EC1118酵母,加入到5%的无菌糖水中,在35 ℃温度条件下摇床活化30 min,直至糖水中出现大量小气泡为止。

1.2.2 工艺流程

工艺要点:葛根洗净切丁,60 ℃干燥,粉碎后,过40目筛,在80 ℃水浴糊化30 min。参照文献[19]稍作修改,进行发酵前葛根淀粉的液化和糖化处理。在一定料水比、发酵初始pH、发酵温度和酵母接种量条件下发酵7 d后,经过滤得到成品,再对酒样进行感官评定。

1.2.3 感官评定 由20位(10男10女)经过感官评定的食品专业学生组成评价小组,为了提高可信度,评价员在评价前12 h不喝酒、不吸烟、不吃辛辣等刺激性的食品,评价结束后不准讨论,评价下一样品前,用清水漱口。填写感官评定表,评价标准[20-21]如表1所示。

表1 葛根酒感官评定指标Table 1 The sensory evaluation of gegen wine

1.2.4 模糊数学模型的建立

1.2.4.1 葛根酒的因素集和评价集 因素集是影响被评判对象的指标集合[15],以色泽(u1)、香气(u2)、滋味(u3)、典型性(u4)为4个因素,如表2所示,得到本研究的因素集U={ u1,u2,u3,u4}。

评语集是评价者对因素集反馈信息的结合,即为评级的等级[22]。以优(v1)、良(v2)、中(v3)、差(v4)为评语等级,得到本研究的评语集V={ v1,v2,v3,v4}。

1.2.4.2 权重的确定 权重集就是评语集中各指标在总体感官品质中所占比重的集合,每个评语集对应一个权重系数[21]。请5位专业品评老师根据品评经验及结果,给出权重模糊子集X={x1,x2,x3,x4}的隶属度,xi=(1,2,3,4)为本研究的4个因素在感官整体品评中的重要程度,其隶属度的数值范围在0～1之间(保留2位小数),0为不重要,1为最重要。根据5位专家给出的数据构成5行4列的矩阵,然后对其进行行归一化处理,最后对每一列进行平均值的计算,即得到评价指标模糊权向量a={a1,a2,a3,a4}。

1.2.4.3 模糊关系综合评价集 参考文献[15,20],采用模糊合成算子建立模糊综合评价模型。将权重集a与模糊关系矩阵R相乘,得到模糊关系综合评价集B=a·R。本研究采用秩加权平均原则对模糊综合评价结果进行处理,用4、3、2、1依次代表优、良、中、差,并作为各等级的秩,通过式(1)得到最后的等级值T。

式(1)

式(1)中,k:待定系数(取k=2),目的是控制较大的Bi所引起的作用。

1.2.5 发酵工艺条件的优化

1.2.5.1 单因素实验 固定发酵初始pH5.0、发酵温度28 ℃、酵母添加量0.4%,考察不同料水比(1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7 (g/mL))对葛根酒的影响;固定料水比1∶5、发酵温度28 ℃、酵母添加量0.4%,考察不同发酵初始pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)对葛根酒的影响;固定料水比1∶5、发酵初始pH5.0、酵母添加量0.4%,考察不同发酵温度(22、25、28、31、34 ℃)对葛根酒的影响;固定选择料水比1∶5、发酵初始pH5.0、发酵温度28 ℃,考察不同酵母添加量(0.2、0.3、0.4、0.5、0.6%)对葛根酒的影响。按照上述条件发酵完成后,以模糊数学得到的感官评价对蕨根米酒的品质进行分析,确定单因素最佳条件。

1.2.5.2 响应面优化试验 在单因素实验的基础上,采用Design-Expert 6.0.5软件,根据Box-Behnken试验设计,选择pH(A)、发酵温度(B)、酵母添加量(C)这3个为响应变量,以模糊数学得到的感官评价为响应值,进行3因素3水平响应面优化试验(表2)。

表2 响应面试验因素水平表Table 2 Factors and levels table usedin Box-Behnken experiment

1.2.6 香气成分的测定 参考Wang等[24]的方法稍作修改,采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)进行检测。

顶空固相微萃取:取4 mL样品于15 mL顶空瓶中,再加入1 g NaCl和一个磁力转子,然后用聚四氟乙烯隔垫密封。在50 ℃水浴平衡10 min,开启磁搅拌器,将萃取头插入顶空瓶中吸附30 min,然后在GC进样口热解析5 min,进行GC-MS分析。

GC-MS条件[24-25]:所用的色谱柱为DB-Wax毛细管柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm);程序升温:40 ℃保持3 min,以4 ℃/min升至160 ℃,再以7 ℃/min升至230 ℃,保持10 min;进样口温度为250 ℃;氦气流速为1 mL/min;不分流。传送线温度为230 ℃;离子源温度为230 ℃;EI离子源能量为70 eV;质谱扫描范围m/z为33～450,扫描间隔为1 s。

香气成分定性定量分析:利用计算机自带的NIST谱库进行对比分析,并参考相关文献,对其进行定性分析;以2-辛醇(在体系的浓度为0.125 mg/L)为内标,采用半定量的方法来计算香气物质的含量(如式2所示)。

待测香气成分的含量=(待测香气成分的峰面积×内标物含量)/内标物的峰面积

式(2)

1.2.7 理化及微生物指标的测定 酒精度的测定:酒精计法[21];残糖含量的测定(以葡萄糖计):直接滴定法[23];总酸的测定(以乙酸计):酸碱滴定法[23];甲醇含量的测定:气相色谱法[23];菌落总数的测定:参照得到的数据GB/T 4789.2-2010《食品卫生微生物检验 菌落总数测定》;大肠菌群的测定:GB/T 4789.3-2010《食品卫生微生物检验 大肠菌群测定》;沙门氏菌的测定:GB/T 4789.4-2010《食品卫生微生物检验 沙门氏菌测定》;志贺氏菌的测定:GB/T 4789.5-2010《食品卫生微生物检验 志贺氏菌测定》;金黄色葡萄球菌的测定:GB/T 4789.10-2010《食品卫生微生物检验金黄色葡萄球菌测定》。

1.3 数据处理

采用Excel 2003软件对数据进行处理,Origin 8.0软件进行图形绘制,Design-Expert 6.0.5软件进行响应面试验设计与结果分析。

2 结果与分析

2.1 葛根酒感官品质的模糊综合评价

2.1.1 感官评价 20位感官评价者按照制定的标准,对在单因素条件料水比1∶3、发酵初始pH5.0、发酵温度28 ℃、酵母添加量0.4%下发酵的葛根酒进行感官评价,评品结果见表3,并对品评结果进行归一化处理得到模糊关系矩阵R单1。同样的方法得到其他单因素条件下的模糊关系矩阵。

表3 单因素条件1的品评结果Table 3 The evaluation results of single factor condition No.1

2.1.2 评价指标的模糊权向量 5位专业品评老师给出权重模糊子集M,并对其进行归一化处理见表4。得到模糊权向量a={0.16,0.23,0.42,0.19}。

表4 不同指标的隶属度及归一化处理结果Table 4 The membership degree of different indictors and the results of normalization processing

2.1.3 模糊综合评价模型 以R单1为例,确定其模糊综合评价模型B单1,同理可以得到其他单因素结果的评价模型。再根据秩加权平均原则式(1)计算出T单1=2.11,即处于等级良和中之间,更偏向于中,同理可以得到其他单因素结果的模糊评价等级值T。

T单1=a·R单1=(0.16 0.23 0.42 0.19)

2.2 单因素实验结果

2.2.1 最适料水比的确定 由图1可以看出,不同料水比对葛根酒感官评价等级值有较大的差异,加水量过少或过多,均会影响葛根酒的品质。料水比为1∶3～1∶5时,葛根酒的感官评价等级值逐渐升高;料水比为1∶5～1∶7时,葛根酒的感官评价等级值逐渐降低;在料水比为1∶5时,葛根酒的感官评价等级值为3.70,感官评价等级最高。因此选择1∶5为最适料水比。

图1 不同料水比对感官评价等级值的影响Fig.1 Effects of different material/water ratio on sensory evaluation grade value

2.2.2 最适发酵初始pH的确定 发酵过程中发酵液的pH直接影响微生物的生长,从而影响发酵产物的形成。由图2可知,发酵初始pH为4.0～5.5时,葛根酒的感官评价等级值逐渐升高;发酵初始pH为5.5～6.0时,葛根酒的感官评价等级值逐渐降低;在发酵初始pH为5.5时,葛根酒感官评价等级最高。因此,选择发酵初始pH为5.5。

图2 不同发酵初始pH对感官评价等级值的影响Fig.2 Effects of different fermentation initial pH on sensory evaluation grade value

2.2.3 最适发酵温度的确定 微生物的生长代谢与温度息息相关,发酵温度的高低会影响微生物代谢产物的形成及产品的品质。由图3可知,发酵温度为22～28 ℃时,葛根酒的感官评价等级值逐渐升高;发酵温度为28～34 ℃时,葛根酒的感官评价等级值逐渐降低;发酵温度为28 ℃时,葛根酒感官评价等级最高。因此,选择28 ℃为最适发酵温度。

图3 不同发酵温度对感官评价等级值的影响Fig.3 Effects of different fermentation temperatures on sensory evaluation grade value

2.2.4 最适酵母添加量的确定 由图4可知,随着酵母添加量的增加,葛根酒的感官评价等级值呈现先升高后降低的趋势。酵母添加量为0.2%～0.5%时,葛根酒的感官评价等级值逐渐升高;酵母添加量为0.5%～0.6%时,葛根酒的感官评价等级值逐渐降低。这是因为,当酵母接种量较低时,酵母菌繁殖较慢,使得原料的利用率不高,从而使感官综合等级偏低。酵母接种量过高时,酵母菌大量繁殖,消耗了原料中大量的碳源,导致发酵提前结束,并且酵母会发生自溶的情况,影响产品的风味。故选择0.5%为最适酵母添加量。

图4 不同酵母添加量对感官评价等级值的影响Fig.4 Effects of different yeast inoculums concentrations on sensory evaluation grade value

2.3 响应面试验结果

20位感官评价者按照制定的标准对17组试验的酒样进行感官评定,并对品评结果进行归一化处理得到模糊关系矩阵R1～R17,根据上述算法可以得到模糊评价等级值T1～T17。

采用Design-Expert 6.0.5软件,根据Box-Behnken试验设计,结果如表5所示。并对评定结果进行方差分析结果见表6。通过对各因素进行多元回归拟合后,得到以等级值(Y)与各因素的回归方程为:

表6 回归模型的方差分析Table 6 Variance analysis of the regression model

表5 响应面试验设计及结果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiment

Y=-142.26903+34.49433A+2.08031B+78.1875C-2.521A2-0.027528B2-46.275C2-0.10333AB-7.2AC+0.275BC

从方差分析的结果可以看出,模型极显著(p<0.01),失拟项不显著(p>0.05),说明拟合模型能较好的对响应值进行预测,模型可用。拟合模型的决定系数R2=0.9413,表明模型方差拟合度较好。各因素之间存在交互作用的影响,而不是简单的一次关系。其中方程一次项B极显著(p<0.01),A、C均不显著(p>0.05);交互项AC极显著(p<0.01),AB、BC均不显著(p>0.05);二次项B2显著(p<0.05),A2、C2均极显著(p<0.01)。

通过软件Design-Expert 6.0.5分析,得到最佳发酵条件为:发酵初始pH为5.5、发酵温度为30 ℃、酵母接种量为0.5%,在此条件下预测感官评价等级值为3.63,即发酵制得的葛根酒的品质介于优良之间,更偏于优。在此条件下进行了三次平行试验,验证其模型的有效性,最终得到感官综合评价等级值为3.68±0.03,与预测值相差不大。说明该模型能较好地反映发酵条件与感官评定之间的关系,因此采用响应面法得到的实验条件及结果可靠。

2.4 葛根酒的成分分析

2.4.1 葛根酒香气成分分析 采用HS-SPME结合GC-MS法对葛根酒的香气成分进行检测并分析,结果如表7。共检测出30种香气物质,醇类12种、酯类10种、酸类5种、醛类1种、酮类1种、酚类1种,醇类、酯类和酸类物质的含量分别为8.414、2.229、0.312 mg/L。

表7 葛根酒中挥发性香气物质及含量Table 7 The volatile aroma compounds and content in gegen wine

葛根酒的风味不是由单一香气成分形成,而是源于构成风味结构组分的醇类、酯类、酸类、醛类等相互协调作用而形成[26]。醇类物质是葛根酒中含量较多的一类香气物质,主要是由酵母代谢产生。葛根酒中醇类物质较多为异戊醇(3.682 mg/L)、苯乙醇(2.473 mg/L)、异丁醇(1.463 mg/L)、异丙醇(0.518 mg/L)和正丙醇(0.164 mg/L)等高级醇。高级醇是在发酵过程中有助于调节酵母中间代谢的副产物[27],同时高级醇是风味活性酯的前提物质[28],对葛根酒的风味的形成具有重要作用。其中异戊醇和苯乙醇含量相对较高,这与史路路[29]和蒋鹏飞[12]的研究报道一致,异戊醇具有浓郁的苹果白兰地香;苯乙醇是酒中特征的香气物质,由苯丙氨酸代谢产生,具有迷人的玫瑰香味。在葛根酒中还检测出了香茅醇(花香和柑橘香)、糠醇(焦香)和桉叶油醇(樟脑、青草香),这些物质是赋予葛根酒丰富香味层次的不可忽视的挥发性成分。

酯类物质具有令人愉悦的花香和水果香气,对葛根酒芳香的呈现有不可替代的作用。在葛根酒中检测出的酯类多为乙酯类,例如乙酸乙酯(水果香)、己酸乙酯(苹果香、茴香)、辛酸乙酯(菠萝香、花香)、癸酸乙酯(椰子香)、月桂酸乙酯(花香、水果香、奶油香)、棕榈酸乙酯(奶油香)、苯甲酸乙酯(水果香)[30],乙酯类化合物较多可能是由于乙醇的大量存在[31]。此外在葛根酒中还检测出乙酸异戊酯(清香、香蕉香)、乙酸苯乙酯(甜蜜的玫瑰香)等,这些酯类给予葛根酒果香及花香,对其风味具有积极的作用。

较醇类和酯类物质,葛根酒中酸类物质含量明显较少。酒中的大多酸类物质来源于酵母代谢的副产物[31],在葛根酒中检测的酸类物质有乙酸、异丁酸、己酸、辛酸、癸酸,在蒋鹏飞[12]分析葛根酒的挥发性成分中也检出这几种酸类物质。一般C6～C12脂肪酸具有奶酪和油脂气味,因此这些酸类化合物组成了葛根酒愉快的奶酪和脂肪香味。此外酸类化合物还影响酒的滋味,酒体中酸类物质较少时,酒味寡淡且余味短;酸类物质较多时,酸味重,酒味烈且粗糙[12]。因此只有适量的酸类化合物才能使酒中各类香气成分协调、平衡。

此外,在葛根酒中还检测出了乙缩醛(芳香)、3-羟基-2-丁酮(愉快的奶香)这两种醛类物质和酮类物质,同时在梁香[32]发酵的薏米葛根黄酒、史路路[29]发酵的葛根黄酒、蒋鹏飞[12]发酵的葛根酒中均未检测出,可能是由于酵母种类和原料的差异所致,其中3-羟基-2-丁酮在酒类调香中具有重要作用。Berenguer等[33]研究表明,醛类、酮类等物质虽然含量较少,但对酒体风味的形成具有重要作用。正是由于葛根酒中醇、醛、酸、酯等组分构成了其特有的风味,使得葛根酒不仅具有较好的滋味,且具有一定的保健功效。

2.4.2 葛根酒理化成分分析 对发酵条件优化后得到的葛根酒进行理化成分分析,结果如表8所示。酒精体积分数为8.16%±0.25%,残糖含量为(6.38±0.12) g/L,总酸含量为(4.46±0.08) g/L,甲醇含量为(0.23±0.01)g/L,符合国家标准,菌落总数小于47 CFU/mL,大肠菌群和致病菌均未检出。

表8 葛根酒主要理化成分及微生物分析Table 8 Analysis of main components and microbes of gegen wine

3 结论

通过模糊综合评定结合响应面法对葛根酒发酵条件进行优化,得到最优发酵条件为:发酵初始pH5.5、发酵温度30 ℃、酵母接种量0.5%,在此条件下感官评价等级值为3.68,品质等级介于优良之间,更偏于优。葛根酒中共检测到30种香气成分,醇类以异丁醇、异丙醇、苯乙醇为主;乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯在酯类物质中相对较多;此外检测出酸类、醛类、酮类物质,这些香气物质相互融合协调,构成了葛根酒独特的风味。发酵后葛根酒的酒精体积分数为8.16%,甲醇含量和微生物指标均符合国家标准,酒呈棕黄色,澄清透明,葛根清香和酒香协调、平衡,清冽爽口。采用模糊综合评定结合响应面法优化发酵参数和HS-SPME/GC-MS法测定葛根酒的香气成分具有一定的实用价值,对葛根资源的开发与利用提供理论依据和数据支持。