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(1.广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524008;2.广东省亚热带果蔬加工科技创新中心,广东湛江 524008;3.广东省现代农业(热带特色园艺)产业技术研发中心,广东湛江 524008)

菠萝蜜(ArtocarpusheterophyllusLam.)又称木菠萝,在中国种植已有1000多年的历史,主要集中在海南、广东、广西、云南、福建和四川南部等热带、亚热带地区[1]。菠萝蜜的果实柔软可口,香气扑鼻,是热带的一种珍贵药材。菠萝蜜的整果含有含有丰富的糖类、蛋白质、B族维生素、维生素C、矿物质、脂肪油等,菠萝蜜酿造的果酒能够更好地保存菠萝蜜原有的风味和各种营养成分[2],但是相比其他水果,关于菠萝蜜果酒发酵的研究较少。

王大陆等[3]对菠萝蜜果酒酿造工艺进行了研究,得出了菠萝蜜果酒最佳工艺条件。张玲等[2]对菠萝蜜果酒加工工艺做了进一步研究,在接种量为5%,发酵前糖度20%,酸度为4.5,于28 ℃发酵9 d,得到的菠萝蜜果酒整体质量最好,并对果酒的澄清工艺进行了研究,优化了菠萝蜜果酒生产工艺,最终制得的菠萝蜜果酒具有良好的稳定性,属于半甜型低度酒,酒体色泽金黄,口感柔和。关红艳[4]研究得出了发酵菠萝蜜果酒口感最佳的条件。研究者使用的果酒酵母都是市售的酵母,而没有筛选出菠萝蜜果酒专用酵母。目前,菠萝蜜果酒研究基本上停留在实验室阶段,缺乏菠萝蜜果酒专用酵母。

因此,本文以菠萝蜜为原料进行自然发酵,培养出大量菌株,再经过逐级筛选出适合菠萝蜜果浆发酵的菌种,并对其多方面性能进行测试,以期筛选出菠萝蜜果酒的专用酿造酵母,解决菠萝蜜果酒发酵过程中酵母菌产率低、难保存、易变异等问题,提高菠萝蜜果酒发酵过程中酵母菌的产酒率,并使该种酵母能够连续稳定的发酵菠萝蜜果浆,从而为菠萝蜜果酒的工业生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菠萝蜜 购于广东湛江种植农地;硝酸钾、硫酸铵、氢氧化钠、NaCl、柠檬酸、可溶性淀粉、无水乙醇、蔗糖、乳糖、果胶酶(酶活力10000 UPTE/mL) 泰州聚丰源生物科技有限公司;富集培养基(麦芽汁琼脂培养基):麦芽浸粉加入4倍水后60 ℃保温糖化,用碘液检验至糖结束,用蔗糖调糖至10 °Bx,分装,121 ℃,20 min;菠萝蜜发酵培养基(菠萝蜜果浆):菠萝蜜榨汁(添加二氧化硫80 mg/L,果胶酶处理100 mg/L),于115 ℃灭菌15 min。

BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司;WYT-4手持糖度计 郑州南北仪器设备有限公司;HR7625打浆机 PHLIPS;XSP-2CA生物显微镜 上海光学仪器厂;GZX-9240MBE数显鼓风干燥箱 上海右一仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酵母菌富集培养和分离纯化 选择成熟干净的菠萝蜜果肉打浆,添加二氧化硫100 mg/L,果胶酶100 mg/L 30 ℃处理3 h,用蔗糖调糖度为21 °Brix,自然pH。在500 mL无菌三角瓶中添加打浆液300 mL,28 ℃发酵直到无气泡产生[5]。取10 mL菠萝蜜果浆自然发酵液用无菌水稀释至10-1,再逐步稀释到10-6,并在每组中进行三次平行试验。振荡5 min后,吸取0.1 mL上清液涂布麦芽汁琼脂固体培养基上,28 ℃恒温48 h。待菌株长出菌落后,挑取表面光滑奶油状,有酒香的单菌落划线分离2～3次[5],最后将单个典型菌落移植于YPD培养基中保存。

1.2.2 酵母菌一级筛选 采用TTC法[8]。在YPD固体培养基中接入分离的各菌株,24 h在长出的菌落上覆盖一层含0.5%TTC显色剂的YPD固体培养基,形成双层培养基。酒精浓度不一的酵母菌落会显示各种颜色,深红色是高浓度酒精的菌落[6],从中挑选具有良好性状和深色的酵母菌株,并且重复试验三次。

1.2.3 酵母菌二级筛选 选采用杜氏管发酵法,在含有杜氏小管的YPD培养液中接入一级筛选的菌株,分别在24、48 h录杜氏管中出现气体的情况。重复三次。根据产气时间和产气量的多少筛选出耐高温和发酵性能好、起酵快的酵母菌株。

1.2.4 酵母菌三级筛选 在菠萝蜜果浆中接入菌种,28 ℃培养7 d[8],拆开封口膜,轻轻晃动锥形瓶,对发酵液的气味进行感官评定。筛选出有产酒香味并伴有菠萝蜜特征香味能力的酵母菌,再进一步进行感官评定。最后得到发酵性能良好的菠萝蜜果酒酵母。

1.2.5 酵母菌鉴定

1.2.5.1 细胞形态学鉴定 对最后得到的菌株在显微镜下进行细胞形态的观察。

1.2.5.2 生理生化试验 发酵糖类试验、同化碳源试验同化氮源试验、其他生理生化试验(无维培养、高渗培养、0.01放线菌酮培养)[9]。

1.2.5.3 筛选菌株的26S rDNA序列分子生物学鉴定 本实验采用通用引物26S rDNA[9],其PCR扩增:94 ℃预变性4 min,94 ℃变性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,共30个循环,最后72 ℃延伸10 min。由上海生工生物公司测序,并运用Blast程序与数据库中已存在的真菌26S rDNA核苷酸序列进行相似性比较分析,选取其中同源性较高的菌株,用MEGA 软件计算序列相似性并进行系统发育树分析,构建系统发育树。

1.2.6 性能试验

1.2.6.1 温度耐受性试验 取菠萝蜜果浆调节糖度为21 °Brix,接种量为7%,将待发酵液分别放置在25、28、31、34、37、40 ℃温度下发酵,培养7 d后用蒸馏法[10]测分别其酒精度。

1.2.6.2 pH耐受性试验 分别用柠檬酸和氢氧化钠溶液将菠萝蜜汁的pH调节至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5,糖度为21 °Brix,接种量为7%,于28 ℃条件下培养7 d,用蒸馏法测发酵液酒度[10]。

1.2.6.3 初始糖度耐受性试验 用白糖将菠萝蜜果浆糖度调整为17、21、25、29、33 °Brix,接种量为7%,于28 ℃条件下培养7 d,用蒸馏法测其酒精度。

1.2.6.4 SO2耐受性试验 在菠萝蜜汁培养液中分别添加亚硫酸钠80、100、120、140、160 mg/L,糖度为21 °Brix,7%的接种量在 28 ℃的条件下培养7 d,用蒸馏法测发酵酒度。

1.2.6.5 酒精度耐受性试验 用2%的蔗糖水活化酵母,分别取200 μL加入酒精含量为1%、3%、5%、7%、9%、11%的15 mL的带杜氏管液体培养基,摇匀,分别测定初始吸光度值,置于28 ℃恒温培养箱培养24 h,在560 nm紫外光下测定吸光度,48 h再次测定吸光度。

1.2.6.6 酵母菌传代稳定性测定 将酵母菌传8代,将1～8代的酵母菌接入菠萝蜜果浆,接种量为7%,28 ℃的条件下培养7 d用蒸馏法测其酒精度,观察菌株传代稳定性。

1.3 数据处理

用Excel 2010工作表进行数据处理

2 结果与分析

2.1 酵母菌分离纯化结果

根据酵母菌的菌落特征及显微镜形态特征[11],分离出90株酵母菌,结果如表1所示。分离的酵母菌观察到菌落的颜色大部分是白色或乳白色,中间的颜色与边缘的颜色相同,有的散发出愉悦的酒香味。在显微镜下观察到的酵母菌有正圆形、椭圆形、短杆状等;繁殖方式为一端出芽。将分离出的90株酵母菌根据菌落形态命名为A1～A36、B1～B27、C1～C27。

表1 酵母菌分离结果Table 1 Results of yeast isolation

2.2 酵母菌一级筛选结果

一级筛选结果如表2所示。由表2可以看出,经过24 h培养和3 h显色剂显色后,有12株酵母菌呈红色,有48株酵母菌呈深红色。下一步将使用这60株产酒能力较强的酵母菌进行二次筛选。

表2 TTC显色法筛选结果Table 2 The results of TTC color demonstration test

2.3 酵母菌二级筛选结果

二级筛选结果如表3所示。结果显示,培养48 h后有30株酵母菌产生气体,其中产气充满杜氏管体积的有13株。产气情况为“++”和“+++”的25株酵母菌的试管不时出现气泡,底部均有沉淀,说明这些酵母菌的生长和发酵速率较强。下一步将对这25株菌进行三级筛选。

表3 杜氏管法筛选结果Table 3 The results of durham ture test

2.4 酵母菌三级筛选结果

在菠萝蜜果浆中接种活化的25株酵母菌,发酵7 d后进行感官评定筛选。其筛选结果如表4所示。

表4 发酵液感官评价结果Table 4 Sensory evaluation of zymotic fluid

在25瓶发酵液中,有的散发出酒味和菠萝蜜特殊香味,也有的出现酸臭味等不良气味。对筛选出的9株有产酒香味并伴有菠萝蜜特征香味能力的酵母菌再进一步感官评定,筛选结果如表5所示。

表5 发酵液感官排名结果Table 5 Sensory evaluation of zymotic fluid

C20发酵液的酒香味最高,A21排第二。而A21的菠萝蜜特征香味最强,是典型的菠萝蜜香味。结合发酵液的酒香、菠萝蜜特征香气,选定编号A21的酵母菌为最佳菌株。

2.5 酵母菌鉴定结果

2.5.1 菌落形态与细菌形态鉴定结果 由图1酵母菌A21的菌落形态可以看出,酵母菌A21在培养基上的菌落为凸起奶油状,表面光泽,菌落边缘圆整。酵母菌A21在镜检下的个体形态如图2所示,酵母菌A21的营养细胞是正圆形,繁殖方式为一端出芽。

图1 酵母菌的菌落形态图Fig.1 The colonial morphology of yeast

图2 显微镜下细胞形态图(100×)Fig.2 Cells morphous of the yeast under microscope(100×)

2.5.2 生理生化试验结果 由表6可以看出,A21菌株能将D-葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、菊糖、棉籽糖、海藻糖、D-甘露醇、L-鼠李糖等碳源同化;不能同化赤藓糖醇、L-阿拉伯糖、柠檬酸盐、纤维二糖、木糖醇、D-核糖、琥珀酸等碳源。同化氮源试验结果表明,该株菌株不能同化L-赖氨酸、硝酸钾、尸胺等氮源。同时其他生理生化试验结果表明,该株菌株能够能生长在无维生素培养基上;能够在30、35、40 ℃下生长;能够在50% D-葡萄糖和60% D-葡萄糖中生长;不能在0.01%的放线菌酮中生长。

表6 酵母菌A21生理生化试验结果Table 6 Results of physiology and biochemistry test of yeast A21

根据菌落特征和细胞形态学的观察结果,以及发酵糖、同化碳源、同化氮源、无维生素生长、高温生长、高浓度D-葡萄糖生长、抗放线菌酮等生理生化试验的结果,对照《酵母菌的特征与鉴定手册》[9],可以确定A21为酵母属的酿酒酵母。

2.5.3 分子生物学鉴定结果 如图3构建了包括A21菌株及相关菌种在内的26S rDNA序列系统进化树。Saccharomycesmikatae[12]、Saccharomycesparadoxus[13]、Saccharomyceskudriavzevii[12]是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的3个种。菌株A21与酿酒酵母(S.cerevisiae)的遗传距离最近,二者相似性为100%。据此再进一步确定最后筛选的酵母菌株A21属于酵母属(Saccharomyces)的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

图3 菌株A21的进化树Fig.3 Phylogenetic tree of the yeast A21

2.6 性能试验结果

2.6.1 温度耐受性试验 由图4可得,酵母菌在25～40 ℃的选定范围内,发酵酒精度先升高,31 ℃后又逐渐下降。由于低温抑制酶的活性,影响细胞的代谢活性并抑制酵母的繁殖,因此,在温度低于28 ℃酒精的产率较低。而超过31 ℃时,某些酶活性降低甚至失去活性,导致酵母菌的发酵能力降低。因此此酵母最佳的生长温度为28～31 ℃。

图4 酵母菌温度耐受性试验结果Fig.4 Results of temperature resistance on yeast

2.6.2 pH对酵母菌的影响 由图5可以看出,在pH为4.5～5.5时,随着pH的升高,该酵母菌产酒精能力逐渐增强,在pH为5.5时,产酒精能力最强,在pH大于5.5时,酵母菌产酒精能力逐渐减弱。由此可见,该酵母菌在较低的pH条件下,酵母菌会发生应急反应,使细胞内产生大量的活性氧,而这些活性氧气会攻击细胞中的膜脂、DNA等物质,损伤细胞[14]。因此此酵母最佳发酵pH为5.5。

图5 酵母菌pH耐受性试验结果Fig.5 Results of pH resistance on yeast

2.6.3 初始糖度对酵母菌的影响 从图6中得出,在初始糖含量为17～29 °Brix时,该酵母菌产酒能力随着糖度的增加而提高,在初始糖度为29 °Brix时,产酒精能力最高。当初始糖度大于29 °Brix时,外部环境的渗透压也随之增加,从而抑制酵母菌细胞代谢酶的活性,所以产酒能力开始下降。因此此酵母最佳发酵初始糖度为29 °Brix。

图6 酵母菌初始糖度耐受性试验结果Fig.6 Results of initial brix tolerance test on yeast

2.6.4 二氧化硫耐受性 添加SO2不仅能抑菌杀菌,还能抗氧化和澄清果汁。由图7得出,当SO2浓度小于80 mg/L时,发酵酒精度随SO2浓度的升高而升高,当SO2浓度为80 mg/L时,该酵母菌酒产酒精能力最高,当SO2浓度大于80 mg/L时,随着SO2浓度的增加而逐渐降低。因此最适SO2添加量为80 mg/L。

图7 酵母菌SO2耐受性试验结果Fig.7 Results of sulfur dioxide tolerance on yeast

2.6.5 酒精度耐受性 从图8可以看出,同一初始酒精度的酵母菌随着时间的增长,酵母菌吸光度均增大,说明酵母菌在生长繁殖,培养基中酵母菌浓度增大。对于不同的初始酒精浓度,随着初始酒精含量的增加,在600 nm可见光下的吸光度值随着时间的增加幅度下降,说明初始酒精度对酵母菌的生长产生了抑制。在初始酒精度达到7%的时候,酵母菌48 h吸光度增加量明显下降,此时酵母菌的生长被抑制,在初始酒精度为11%时,酵母菌吸光度增长很小,已接近酵母菌酒精度耐受性极限。

图8 酵母菌酒精度耐受性Fig.8 Alcohol tolerance of yeast A21

2.6.6 酵母菌传代稳定性测定 图9表明,同一条件每代发酵的酒精度接近一致,酵母菌A21的传代稳定性良好,产酒精能力稳定,可用来作为后续的改良驯化及菠萝蜜果酒发酵菌种。

图9 酵母菌A21传代稳定性Fig.9 Passage stability of yeast A21

3 结论

本文以菠萝蜜为发酵原料,通过富集培养和分离纯化,经过三级筛选得到一株适用于菠萝蜜果酒发酵的酵母菌A21。通过形态学,生理生化鉴定初步判断A21为酵母,最后结合分子学鉴定为酿酒酵母。对A21为酵母菌的性能测试结果表明,该酵母菌在25～35 ℃能正常生长,最适发酵温度为28～31 ℃,初始糖度为29 °Brix时,产酒精能力最高。在pH5.5时,产酒精能力最强。当SO2添加量为80 mg/L时,产酒精能力达到最高。当初始酒精度为7%时,能抑制该酵母菌的生长,初始酒精度为11%时,接近酵母菌酒精度耐受性的极限。该酵母菌的传代稳定性良好,产酒精能力稳定,产酒精度稳定在10°左右,可用作改良驯化及菠萝蜜果酒发酵菌种。