, ,, ,Josef Voglmeir

(南京农业大学食品科学技术学院,糖组学与糖生物工程实验室,江苏南京 210095)

唾液酸是一类含九个碳原子的羧基化单糖酰化衍生物的总称[1],通常位于糖蛋白、神经节苷脂及多糖胺等寡糖链末端,其主要形式包括游离的唾液酸、唾液酸衍生物及聚唾液酸[2]。唾液酸作为重要的生物信息传递分子在生物体内有着十分重要的生物学功能[3]。

唾液酸醛缩酶又称N-乙酰神经氨酸裂合酶[4],是唾液酸及其类似物代谢途径中的关键酶,能催化N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的可逆羟醛加成反应,调控唾液酸的合成[5]。唾液酸醛缩酶酶多发现于微生物体内,例如大肠杆菌(E.coli)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、假单胞菌(Pseudomnoas)、变形杆菌(Proteus)及微球菌(Micrococcus)等[6]。目前已发掘了E.coli源及流感嗜血杆菌源唾液酸醛缩酶,但市面上可购买的唾液酸醛缩酶种类仍然有限,同时价格较高,因此有必要开发新的来源的唾液酸醛缩酶。解肝磷脂土地杆菌(Pedobacterheparinus)是一种从土壤中分离得到的革兰氏阴性好氧菌[7],其全基因组信息已经公布,但关于Pedobacterheparinus源的唾液酸醛缩酶至今未见相关报道。由于唾液酸醛缩酶在该野生型菌株中为诱导酶,即通常生理状态下不进行表达或者酶量较低,只有以价格昂贵的唾液酸作为诱导剂时才能进行大量表达[8],因此实现该酶的大量异源重组表达是大量获得该酶的必要途径。

目前应用最为广泛的蛋白酶异源表达系统为大肠杆菌表达系统[9]。在该系统中,启动子是决定基因表达水平的关键因素之一,对目的基因的表达载体构建及表达调控等极为重要[10]。启动子是一段能够识别RNA聚合酶的DNA序列,通过指导模板同全酶结合,来启动目的基因的转录[11]。大肠杆菌表达系统中能发挥作用的启动子种类较多,根据其调控方式的不同可分为诱导型启动子和组成型启动子[12]。其中,诱导型启动子需添加诱导剂才能够调控目的基因的表达,如T7·lac启动子需以乳糖类似物作为诱导剂,该类型启动子的优点是能够掌握酶的表达时间和水平[13]。最近的研究报道中,已有不少学者选用组成型启动子来调控外源基因的表达,该类型的启动子能够在细胞开始生长时就自主表达异源蛋白酶,无需添加诱导剂,具有调控方式更为简便、操作成本低等优点[14]。

针对大肠杆菌表达系统中两种启动子各有优势的特点,本研究先以大肠杆菌表达载体pRSFDuet-1为骨架,设计插入组成型启动子,合成组成型表达载体。再以细菌属Pedobacterheparinus作为目标菌株,将其拟编码唾液酸醛缩酶的基因PhNeuLy3300进行扩增,并构建至上述含组成型启动子的表达载体及含诱导型启动子的商业表达载体pET-30a,分别以诱导型启动子和组成型启动子对Pedobacterheparinus源唾液酸醛缩酶进行体外异源表达,旨在以较为经济、简易的表达条件得到重组唾液酸醛缩酶。其中,将含诱导型启动子的pET-30a商业载体表达所得的唾液酸醛缩酶进一步纯化及活性测定,以期得到能运用于后续体外酶学特性研究的纯酶,通过对组成型表达载体表达所得的粗酶进行酶活验证,为唾液酸醛缩酶在大肠杆菌体内合成唾液酸的应用奠定基础,同时也为重组蛋白的表达提供一种新型、高效、方便的表达载体。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株Pedobacterheparinus(DSM 2366) 德国(DSMZ)微生物与细胞保藏中心;基因克隆菌株Top10(经抗噬菌体改后造命名为BMMach1 T1)和大肠杆菌表达菌株E.coliBL21(DE3) 北京天根生化科技有限公司;pGH-T克隆载体 上海捷瑞公司;pET-30a和pRSFDuet-1表达载体 Novagen公司;组成型调控基因序列EM5和PCR扩增引物 由本实验室设计后交南京金斯瑞(genescript)公司合成;rTaq DNA聚合酶 Takara公司;T4 DNA连接酶、去磷酸化酶FastAP以及限制性核酸内切酶Nde I、Xho I Thermo Scientific公司;异丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 北京索莱宝科技有限公司;卡那霉素(50 μg/mL)和氨苄青霉素(100 μg/mL) 南京寿德生物科技有限公司;AxyPrep DNA回收试剂盒和AxyPrep 质粒提取试剂盒 Axygen公司;基因测序 南京金斯瑞(genescript)公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原核表达载体pRSF-EM5的设计合成 首先利用SnapGene软件分析具有不同抗性基因标签的表达载体图谱,获取各类抗性基因(杀稻瘟菌素、氯霉素、链霉素、卡那霉素及潮霉素等)的调控序列,根据Neutral networkpromoter prediction及Vector NTI(V10.0)等软件工具的分析,认为可以其为组成型启动子设计组成型基因调控序列(EM5)模块。该模块由5组酶切位点(Nde I/Xho I、EcoR I/Pme I、Kpn I/Spe I、Sac I/Mfe I及Bgl II/Avr II)与各启动子相互串联形成相对独立的表达盒,并在序列最前面引入Nco I酶切位点。设计的EM5序列交由南京金斯瑞公司合成,再经Nco I、Avr II双酶切后,连接至商业载体pRSFDuet-1,即定向改造得到新的组成型原核表达载体pRSF-EM5。

1.2.2 绿色荧光蛋白在pRSF-EM5载体中的表达 为检测改造后的载体pRSF-EM5能否由组成型启动子启动并完成异源蛋白的自主表达,将编码绿色荧光蛋白的基因(GFP)两端分别添加限制性内切酶位点Nde I/Xho I、EcoR I/Pme I、Kpn I/Spe I、Sac I/Mfe I、Bgl II/Avr II,经聚合酶链式反应(PCR)扩增后,分别连接至pRSF-EM5载体,再将连接产物热激转化至大肠杆菌感受态细胞(BMMach1 T1细胞)中,利用PCR法筛选重组转化子,最后利用Axygen质粒提取试剂盒提取阳性菌落质粒并导入E.coliBL21(DE3)细胞。其中PCR反应体系如表1所示,PCR各引物序列如表2所示,PCR程序设置为:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,循环 35 次,72 ℃ 10 min。挑取适量含重组GFP基因的E.coliBL21(DE3)菌株于5 mL LB培养基中,30 ℃、200 r/min培养表达20 h。待表达完成后,12000 r/min离心收集菌体,于蓝光板上观察菌体颜色。

表2 绿色荧光蛋白基因PCR引物序列Table 2 Primers for PCR amplification of GFP genes

表1 绿色荧光蛋白基因PCR反应体系Table 1 PCR amplification reaction system of GFP genes

1.2.3Pedobacterheparinus唾液酸醛缩酶基因扩增 通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库比对,从Pedobacterheparinus基因组中筛选到疑似编码唾液酸醛缩酶的基因序列,命名为PhNeuLy3300。利用软件Primer Premier5设计其PCR扩增引物,并在引物的5′端分别引入Nde I、Xho I限制性内切酶位点。前引物F:5′-CATATGATGACGATGCAAAAATT AGAA-3′,后引物R:5′-CTCGAGTTATTGTGAAGTG CTGACGC-3′。PCR反应体系如表3所示,其具体扩增程序为:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,循环35次,72 ℃ 10 min。Pedobacterheparinus基因组DNA根据Mahuku[15]等报道的方法进行提取。以基因组DNA为模板进行目的基因的PCR扩增,扩增所得产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测分析,并利用Axygen DNA 回收试剂盒进行切胶回收。

表3 唾液酸醛缩酶基因PCR反应体系Table 3 PCR amplification reaction system of PhNeuly3300

1.2.4 重组表达载体的构建 回收的DNA片段经T4 DNA连接酶作用,连接至pGH-T克隆载体上,再将重组质粒转化至BMMach1 T1细胞中,使用蓝白斑法筛选重组转化子[16],并挑取白色单菌落以M13通用引物进行PCR法鉴定。利用Axygen质粒提取试剂盒对阳性菌落进行质粒抽提,得到的质粒经Nde I、Xho I限制性内切酶进行双酶切,酶切后的DNA片段在T4 DNA连接酶的作用下,分别连至经相同酶切处理的pET-30a和pRSF-EM5表达载体上。再将连接产物转化至BMMach1 T1细胞中,并利用PCR法筛选重组转化子,得到的阳性菌落分别送至公司进行测序,得到构建成功的重组质粒pET-30a-PhNeuLy3300和pRSF-EM5-PhNeuLy3300。

1.2.5 唾液酸醛缩酶的异源表达和纯化 提取重组质粒pET-30a-PhNeuLy3300和pRSF-EM5-PhNeuLy3300,转化至E.coliBL21(DE3)细胞内。分别挑取单菌落于5 mL含卡那霉素(50 μg/mL)的LB培养基中过夜培养,然后接种至400 mL LB培养基中进行扩大培养。其中含重组质粒pRSF-EM5-PhNeuLy3300的菌液于30 ℃、200 r/min条件下培养表达20 h,含重组质粒pET-30a-PhNeuLy3300的菌液于37 ℃、200 r/min条件下培养直至菌液浓度达到OD600为0.5～0.7,加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1 mmol/L,转18 ℃继续诱导表达20 h。

4 ℃、4000 r/min离心收集菌体,利用10 mL细胞裂解液(100 mmol/L氯化钠,1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100),50 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF))将菌体沉淀重悬。将含重组质粒pET-30a-PhNeuLy3300的裂解液经超声进行细胞破碎,4 ℃、12000 r/min离心收集上清,再利用镍亲和层析柱(Ni-NTA)进行纯化。纯化柱经5倍柱体积的平衡缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L氯化钠,pH8.0)平衡后上样,再由10倍柱体积的结合缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl,20 mmol/L咪唑,50 mmol/L氯化钠,pH8.0)冲洗去除非特异性结合的蛋白,最后用10 mL体积的洗脱缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L氯化钠,500 mmol/L咪唑,pH8.0)洗脱目标蛋白,280 nm波长检测洗脱液,收集重组蛋白酶。

将重组蛋白pRSF-EM5-PhNeuLy3300细胞裂解液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),以不含目的重组质粒的E.coliBL21(DE3)细胞裂解液为对照,分析重组蛋白的表达水平。另取pET-30a-PhNeuLy3300诱导前后、上清和纯化后样品进行SDS-PAGE,以分析不同载体中重组酶的表达水平及纯化情况。其中,分离胶电泳电压均为100 V,浓缩胶电泳电压均为80 V。并使用Bradford法的蛋白定量试剂盒,以牛血清蛋白(BSA)绘制标准曲线,测定纯化后的pET-30a-PhNeuLy3300重组蛋白酶浓度,具体操作按说明书进行。

1996年，Worden和Smalley[16]通过研究碳酸盐油气藏中生成H 2 S的化学反应，并结合标志元素硫、碳的同位素数据，烃类与CaSO4的反应方程见式(7)～式(9):

1.2.6 唾液酸醛缩酶的活性测定 重组唾液酸醛缩酶的活性通过酶标仪进行测定。以N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac,400 μmol/L)为底物,与辅酶 I(NAD+,2 mmol/L)、磷酸钠-柠檬酸缓冲液(50 mmol/L,pH6.5)、N-乙酰甘露糖胺脱氢酶(ManNAc Dehydrogenase,10 mU)混合后加入384孔酶标板,最后分别加入纯化后的pET-30a-PhNeuLy3300重组蛋白酶(纯酶,25 μL)和pRSF-EM5-PhNeuLy3300 细胞裂解液(粗酶,25 μL),立即放入酶标仪内,在340 nm波长处进行实时检测(每20 s读数1次(s),共读数700次,温度37 ℃)。以不含Neu5Ac或不含目的重组蛋白酶的组分为阴性对照,其中不含底物的体系以等体积去离子水替代Neu5Ac,其余组分均保持不变,不含目的重组蛋白酶的体系以等体积大肠杆菌细胞裂解上清液(原菌株不含表达目的重组蛋白酶的质粒)替代,其余组分均保持不变。

1.3 数据处理

实验中蛋白酶浓度的测定及重组酶活测定每组重复三次,采用Microsoft Excel 2016软件进行数据整理与曲线图的绘制,应用Adobe Illustrator CS5软件辅助作图。

2 结果与分析

2.1 原核表达载体的改造

商业载体pRSFDuet-1为大肠杆菌蛋白双基因表达载体,含两个多克隆位点,即该载体由两个T7·lac启动子起始转录,因此在大肠杆菌表达系统中需添加IPTG作为诱导剂才能表达异源目标蛋白[17]。为使pRSFDuet-1载体免受诱导剂影响,自主表达外源蛋白,本实验设计了组成型调控序列EM5模块。如图1所示,该模块由表达抗性基因杀稻瘟菌素、氯霉素、链霉素、卡那霉素及潮霉素的调控序列和5组克隆位点相互串联组成,并于各组克隆位点前引入ATG碱基,序列总长为544 bp。其中抗性基因的调控序列能够作为组成型启动子自主启动插入的目的基因的表达,5组酶切位点Nde I/Xho I、EcoR I/Pme I、Kpn I/Spe I、Sac I/Mfe I及Bgl II/Avr II可作为多克隆位点同时插入5种目标蛋白基因,为多基因共表达的实现提供基础。

图1 组成型调控序列EM5的设计Fig.1 Design of constitutive regulatory gene sequence EM5

EM5模块与pRSFDuet-1载体的整合位点如图2所示,组成型调控序列(EM5,B)替换了原载体上的多克隆位点序列(MCS1-MCS2,A),并保留了原载体上第一个T7·lac启动子和核糖体结合位点(Ribosome Binding site,RBS)。根据设计,改造后的pRSF-EM5载体理论上可在大肠杆菌表达系统中同时自主表达5种目的蛋白,不需添加诱导剂。

图2 商业载体pRSFDuet-1与组成型调控序列的整合Fig.2 Integration of pRSFDuet-1 vector and constitutive regulatory gene sequence注:A:商业载体pRSF-Duet1图谱;MCS:多克隆位点;B:组成型表达载体图谱。

2.2 绿色荧光蛋白的表达

鉴于编码绿色荧光蛋白基因序列较短,构建载体方便[18],因此可将绿色荧光蛋白基因克隆至pRSF-EM5载体中,检测改造后的组成型载体是否能够自主表达绿色荧光蛋白,以验证改造后的新载体的功能。

由于EM5的序列设计有5组可用于插入目的基因,因此本研究将绿色荧光蛋白基因分别构建至pRSF-EM5载体上Nde I/Xho I、EcoR I/Pme I、Kpn I/Spe I、Sac I/Mfe I、Bgl II/Avr II等5个克隆位点进行重组表达。重组绿色荧光蛋白的表达结果如图3所示:5组含重组绿色荧光蛋白质粒的菌体沉淀均能在蓝光下发出较强的绿色荧光,而不含该重组绿色荧光蛋白质粒的菌体则无明显可见光,证明设计合成的组成型启动子能被大肠杆菌宿主识别,改造后的载体pRSF-EM5能够在无诱导剂存在的条件下,自主表达插入的外源目的蛋白,从而证明组成型启动子的表达载体构建成功,且每一个克隆位点都具有正常功能,可以单独用于外源基因的插入和表达。除此以外,该载体可以同时承载多个能够自主启动表达的克隆位点,因此可用于进行多个基因共表达的尝试。

图3 重组载体上绿色荧光蛋白自主表达Fig.3 Constitutive expression of GFP with constructed recombinant vector

2.3 目的基因克隆及序列比对

利用生物信息学同源比对的方法,从Pedobacterheparinus(DSM2366)基因组中找到疑似编码唾液酸醛缩酶的基因,并命名为PhNeuLy3300,基因为全长945 bp。通过PCR扩增获得了该完整基因,双酶切后分别与含诱导型启动子的pET-30a及含组成型启动子的pRSF-EM5表达载体连接构建成重组质粒,对质粒进行目标基因序列的PCR扩增后,琼脂糖凝胶电泳验证了插入基因片段的大小,如图4所示,pET30a-PhNeuLy3300及pRSF-EM5-PhNeuLy3300的DNA片段均为单一条带且与预期的理论基因大小一致,证明插入片段正确。

图4 PhNeuLy3300基因PCR结果Fig.4 PCR result of PhNeuLy3300 genes注:M:DNA分子量标准(bp),1:pET30a-PhNeuLy3300基因,2:pRSF-EM5-PhNeuLy3300基因。

测序结果表明克隆得到的重组pET30a-PhNeuLy3300基因及重组pRSF-EM5-PhNeuLy3300基因均与Pedobacterheparinus基因序列匹配。如图5、图6所示,完整开放阅读框全长945 bp,共编码314个氨基酸残基,且pET30a-PhNeuLy3300带有C-端组氨酸标签,而pRSF-EM5载体不带组氨酸标签,也即pRSF-EM5-PhNeuLy3300无C-端组氨酸标签。两组测定序列与GeneBank公布的相应序列同源性均为100%,证明插入片段即为目的基因片段,重组质粒构建成功。

图5 pET30a-PhNeuLy3300酶基因的测序比对结果Fig.5 Comparison result of pET30a-PhNeuLy3300 genes

图6 pRSF-EM5-PhNeuLy3300酶基因的测序比对结果Fig.6 Comparison result of pRSF-EM5-PhNeuLy3300 genes

2.4 重组蛋白的表达和纯化

含重组质粒pET30a-PhNeuLy3300的大肠杆菌经IPTG诱导前后菌体、裂解所得上清液和镍亲和层析柱纯化组分的SDS-PAGE分析结果如图8(A)所示。通过比较IPTG诱导前后菌体的蛋白样品,可见诱导后菌体在分子量30～40 kDa左右具有一明显增强条带,且裂解上清液和纯化后的样品在相同位置都具有信号,应为所表达重组蛋白PhNeuLy3300,其表观分子量与理论分子量36.4 kDa相符合,表明重组质粒pET30a-PhNeuLy3300可在大肠杆菌表达系统中经IPTG诱导进行表达,经镍柱纯化可得到纯度较高的重组蛋白。由改良型Bradford试剂盒测定,所得蛋白浓度-吸光度标准曲线如图7所示,根据相同条件下待测蛋白样品的吸光值以及样品稀释倍数,计算出pET30a-PhNeuLy3300重组蛋白浓度为3.29 mg/mL。

图7 蛋白质浓度标准曲线Fig.7 Standard curve of protein concentration注:BSA:牛血清蛋白

图8 PhNeuly3300酶SDS-PAGE电泳图Fig.8 SDS-PAGE electrophoresis of recombined PhNeuLy3300注:(A)pET30a-PhNeuLy3300重组蛋白酶SDS-PAGE电泳图。M:蛋白分子量标准(kDa);1:IPTG诱导前菌体;2:IPTG诱导后菌体;3:细胞裂解液上清;4:镍亲和层析柱纯化后蛋白。(B)pRSF-EM5-PhNeuLy3300重组蛋白酶SDS-PAGE电泳图。M:蛋白分子量标准(kDa);1:细胞裂解液上清(原菌株不含pRSF-EM5-PhNeuLy3300质粒);2:细胞裂解液上清(原菌株含pRSF-EM5-PhNeuLy3300质粒)。

含重组质粒pRSF-EM5-PhNeuLy3300的大肠杆菌在无诱导剂添加的条件下进行培养,裂解菌体所得上清液的SDS-PAGE分析结果如图8(B)所示。通过与不含目的重组质粒的大肠杆菌上清液进行比较,可见含重组质粒pRSF-EM5-PhNeuLy3300的菌体在分子量30～40 kDa左右具有一增加的蛋白条带,且表观分子量与目的蛋白理论分子量36.4 kDa相吻合,即为所表达的重组蛋白PhNeuLy3300,表明重组质粒pRSF-EM5-PhNeuLy3300可在大肠杆菌表达系统中经组成型启动子作用进行自主表达。

2.5 重组唾液酸醛缩酶的活性研究

唾液酸醛缩酶可以催化可逆的唾液酸裂解生成N-乙酰-甘露糖胺与丙酮酸的反应,故可利用从Neu5Ac转化为N-乙酰-甘露糖胺的酶促反应检测PhNeuLy3300酶的活性。N-乙酰-甘露糖胺的检测则由N-乙酰-甘露糖胺脱氢酶完成。N-乙酰-甘露糖胺脱氢酶能将N-乙酰-甘露糖胺氧化,同时将NAD+还原成NADH,NADH在紫外340 nm下可检测吸光值。故可通过酶标仪验证是否有NADH生成从而间接检测重组PhNeuLy3300酶是否有活性。

活性检测结果如图9所示,pRSF-EM5-PhNeuLy3300粗酶(细胞裂解液)催化底物Neu5Ac的反应(组1),1 h内340 nm处吸光值快速增加且达到最大值;当pET30a-PhNeuLy3300纯酶与底物Neu5Ac同时存在时(组2),340 nm处吸光值明显升高,但反应速率相对缓慢,3 h后340 nm处的吸光值达到最大;而反应中不含底物NeuAc(组3),或不含重组PhNeuLy3300酶时(组4),340 nm处吸光值没有增加;表明N-乙酰-甘露糖胺脱氢酶不能以Neu5Ac为底物进行反应,可判断经诱导型和组成型启动子表达所得的唾液酸醛缩酶PhNeuLy3300均具有较好的活性。

图9 重组PhNeuly3300酶活性检测图Fig.9 Enzyme activity detection of PhNeuLy3300注:组1:pRSF-EM5-PhNeuLy3300重组蛋白酶的活性检测;组2:pET30a-PhNeuLy3300重组蛋白酶的活性检测;组3:不含底物Neu5Ac的活性检测反应;组4:不含PhNeuLy3300目的重组酶的活性检测反应。

3 讨论

发掘新型唾液酸醛缩酶、构建其工程菌,可有效提高唾液酸醛缩酶的异源表达量,免去其在野生型菌株中表达所必需的诱导剂N-乙酰神经氨酸,解决在应用研究中市售商品酶来源稀缺等问题。在过去的二十年里,成千上万的微生物基因组序列已被测出。对这些基因数据进行系统分析,利用基因工程技术克隆并构建重组蛋白酶表达体系,是得到新型唾液酸醛缩酶最简单高效的途径[19]。

本论文利用NCBI等相关网站和软件,对一些酶的基因数据进行分析,在基因序列比对的基础上,从来自土壤中的Pedobacterheparinus细菌中获得了唾液酸醛缩酶基因片段。据相关资料显示,Pedobacterheparinus俗称肝素黄杆菌[20],一般生长于土壤中,该菌种最适生长环境温度为25～30 ℃[21],其作为唾液酸醛缩酶基因的供体菌极易获得。此外,文献报道Dietrich及其同事曾从Pedobacterheparinus细菌中发现其他与糖代谢密切相关的酶,如软骨素酶、肝素合成酶、硫酸酯酶、硫代酰胺酶等[22],且这些酶在实际的糖合成应用中都具有较高的价值,证实Pedobacterheparinus菌株可以作为研究糖代谢途径相关酶的重要基因库[23]。本文是首次从Pedobacterheparinus基因组中克隆表达得到了一种新的具有较高活性的唾液酸醛缩酶,丰富了该酶的资源。后续将进一步开展对该酶的生物酶学特性以及实际应用效果的研究,为该酶的开发利用打下基础。

在构建重组蛋白酶的工程菌过程中,选择合适的表达载体作为骨架尤其关键。表达载体的核心则是启动子,其直接影响目的基因表达方式的经济性以及重组蛋白的表达水平。在大肠杆菌系统中,应用较多的是带有lac/trc/tac以及T7启动子的系列表达载体[24],其中pET系列载体是该类载体的典型代表。本研究中也选择了以含有T7·lac启动子的pET-30a为载体,构建重组唾液酸醛缩酶表达体系,实验结果证明该重组体系仅需以廉价的IPTG为乳糖类似物诱导剂即可表达获得浓度较高的重组唾液酸醛缩酶,载体C端带有的组氨酸标签也解决了目前野生型菌株中低量唾液酸醛缩酶难以分离纯化等问题。但随着基因工程技术的发展,通常需要表达载体能够进一步满足更经济、更简便的调控方式的需要,因此组成型启动子的研究应用越来越广泛。国内杜丽琴等人曾报道过从宏基因文库中克隆出组成型启动子构建至T-载体中[25],成功利用构建的含组成型的启动子表达出了具有活性的淀粉酶,但其组成型启动子的筛选步骤繁琐,得到阳性克隆子的成功率低,且该改造后的载体只含有单个多克隆酶切位点。本研究则以启动抗性基因表达的调控序列为组成型启动子,对商业载体pRSF-Duet1进行改造,方法简易可行。构建的重组质粒pRSF-EM7-PhNeuLy3300在无任何诱导剂添加的情况下成功表达出了具有活性较强的唾液酸醛缩酶,大大降低了唾液酸醛缩酶的表达成本。

本文只利用该改造的pRSF-EM5载体进行了唾液酸醛缩酶的表达。实际上本研究改造后的载体理论上能同时独立自主表达5种蛋白酶,并在本实验室开展的大肠杆菌体内合成糖胺聚糖的研究中成功实践了两种基因的共表达。该研究将编码UDP-葡萄糖异构酶及β-1,4半乳糖基转移酶的基因同时串接至pRSF-EM5载体上,使其在大肠杆菌表达系统中自主表达,并以大肠杆菌体内糖代谢中的UDP-葡萄糖为底物,同时外源补给pNP-木糖受体,在共表达的两种重组酶作用下,于大肠杆菌体内检测到了合成的pNP-木糖-半乳糖,即pRSF-EM5载体可于同一宿主菌株中同时表达两种目的蛋白酶且兼具活性。总而言之,该组合型表达载体的成功构建进一步提供了组成型启动子在多基因共表达的实现过程中的可能性,为生物体内多酶法的合成途径奠定了基础。

4 结论

本文通过对商业载体pRSF-Duet1进行定向改造,合成了可自主表达多种外源蛋白的RSF-EM5载体,利用PCR法成功获得了Pedobacterheparinus菌株中参与合成唾液酸的唾液酸醛缩酶基因,该基因长度约为945 bp。同时采用基因工程技术将该唾液酸醛缩酶基因分别连至大肠杆菌pET 30a载体及RSF-EM5载体,成功构建了两种重组唾液酸醛缩酶质粒。经大肠杆菌表达系统进行异源表达后,发现两种重组质粒均能有效表达目的蛋白酶,其分子量大小与预期相符,且具有较高的催化活性。目前课题组正在研究该酶的酶学特性及其在生物内体合成唾液酸的应用,以期进一步探索该酶的实用价值。