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(1.泰山医学院生命科学学院,山东泰安 271016;2.山东农业大学生命科学学院,山东省农业微生物重点实验室,山东泰安 271018)

乳糖酶(lactase)又称β-半乳糖苷酶(β-galactosidase),具有催化β-半乳糖苷键水解,使乳糖转化为半乳糖和葡萄糖的功能,广泛应用于医药、食品和环保等方面[1-2]。医药方面,乳糖酶主要用于治疗乳糖不耐症[3]。食品工业方面,乳糖酶可用于生产低乳糖制品和低聚半乳糖[4]。低乳糖乳制品可供乳糖不耐受人群食用;而低聚半乳糖是很好的益生元,它难以被人体吸收,但能被肠道内双歧杆菌所利用,还具有糖类的共有属性和较好的口感,能够改善肠道菌群、增强免疫系统,被广泛用于制作高血脂、肥胖、糖尿病人的无热量食品[5]。环境保护方面,乳清是生产干酪和干酪素的副产品,含有乳糖、维生素和乳清蛋白等营养成分,每年世界上约产乳清 9×107吨,其中50%当废水排放,不仅造成浪费,而且污染环境[6]。利用乳糖酶可将乳清中的乳糖分解为葡萄糖和半乳糖,用以制造乳清糖浆或作为添加剂添加到食品中,从而达到综合开发利用乳清资源,减少环境污染的目的[7]。

乳糖酶的来源丰富,包括动物来源和微生物来源。微生物具有生长繁殖快、产量高的优点,在实际应用时一般从微生物中得到,主要包括产乳糖酶细菌、酵母菌和霉菌[8]。不同来源的微生物乳糖酶性质也不同,细菌和酵母所产乳糖酶最适pH近中性,适用于牛乳的水解;霉菌所产的乳糖酶最适pH偏酸性,适用于干酪与酸性乳清的水解[9]。然而天然微生物的乳糖酶产量低,为提高乳糖酶产量,使其能更好地应用于工业生产,国内外开展了关于菌株诱变育种、发酵条件优化以及基因重组等研究[10-14]。这些研究工作的进行,都应以产量较高、性能稳定的原始菌株为基础,故而乳糖酶高产菌株的筛选工作依然重要。

我国西部牧区主要包括新疆、青海、甘肃、西藏等牧区,因其具有低温、高海拔、高辐射、寡营养等特殊条件,造就了该区丰富独特的菌种资源[15]。牧民采用传统方法制作乳制品过程中,伴随着大量微生物的生长代谢活动[16]。目前针对乳制品中菌种资源的开发,主要是对其中所蕴含的微生物进行分离鉴定及多样性分析[17-22],而从中筛选高产乳糖酶菌株的报道很少。仅巨蕾等人从甘南牧区牦牛乳酸奶中筛选到产乳糖酶的肠杆菌属Enterobactersp.SYA2,并研究了该菌株的产酶条件[23]。本研究拟从采集自西藏牧区的牦牛奶酪中筛选高产乳糖酶菌株,同时研究乳糖酶的酶学特性,为进一步开发利用产乳糖酶微生物资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酸奶酪 购买自藏区牧民自制10份,分装于10个无菌保鲜袋中并编号,置于冰盒中带回实验室,放在4 ℃冰箱中保存；邻硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG,色谱纯)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal) 北京索莱宝科技有限公司;邻硝基苯酚(ONP,分析纯) 乳糖阿拉丁试剂有限公司。

初筛培养基:乳糖20 g,酵母膏10 g,蛋白胨10 g,X-gal 0.04 g,水1000 mL,琼脂20 g,pH7.0。发酵培养基:乳糖15 g,蛋白陈20 g,酵母膏3 g,NaCl 3 g,K2HPO41 g,MnCl20.1 g,水1000 mL,pH7.0。牛肉膏蛋白胨培养基:蛋白胨10 g,牛肉膏3 g、NaCl 5 g,琼脂20 g,水1000 mL,pH7.0～7.2。磷酸盐缓冲液(pH6.5):磷酸二氢钾0.68 g,加0.1 mol/L氢氧化钠溶液15.2 mL,用蒸馏水稀释至100 mL。

SW-CJ-2FD型超净工作台、SPX-250B5H-Ⅱ型生化培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司;ZQLY-180S型振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司;3-30K型低温高速离心机 Sigma公司;HVE-50型高温灭菌锅 上海精宏实验设备有限公司;DK-8D型电热恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司;UV757CRT型紫外可见分光光度计 上海棱光技术有限公司;超声波细胞破碎仪 宁波新芝生物技术有限公司。

1.2 菌种初筛

称量1 g样品加入到灭菌的研钵中,用杵研碎后加入到9 mL的无菌水中,将体积分数从10-1依次稀释到10-7,选择10-3～10-7五个梯度浓度的样品稀释液,涂布于含有0.04 g/L X-gal的初筛培养基上,37 ℃下培养24 h,选取变蓝的菌落分纯后编号,接入发酵培养基中以备复筛。编号方法为:在样品编号后面直接编号。如RTM-111即为从RTM-1号奶酪样品中分到的11号菌落。

1.3 菌种复筛

将初筛得到的菌株接种于发酵培养基中,37 ℃、150 r/min振荡培养24 h,取培养液20 mL。4 ℃、6000 r/min离心15 min,收集菌体沉淀并用0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH6.5)洗涤两次,加入0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH6.5)至20 mL,超声破碎15 min,4 ℃、12000 r/min离心15 min,取上清液即为乳糖酶粗酶液,通过测定酶活以进行菌种复筛。

1.4 乳糖酶活力的测定及标准曲线的绘制

1.4.1 乳糖酶活力测定 参照参考文献[23],以ONPG为酶作用底物,取0.5 mL酶液,37 ℃下水浴5 min,加入已预热至37 ℃的含5 mmol/L ONPG磷酸盐缓冲液(pH6.5)1.5 mL,37 ℃下水浴反应10 min,然后立即加入3 mL 0.5 mol/L Na2CO3终止反应,于420 nm下测定OD值,测定3次取平均值。以加热失活的酶液或蒸馏水作为空白。一个酶活力单位定义(U)为:在37 ℃每分钟水解释放1 μmoL ONP所需的酶量。

X=(C×5×N)/(0.5×10)

其中,X为乳糖酶活力;C为标准曲线上对应的ONP浓度;N为稀释倍数。

1.4.2 标准曲线绘制 取6支试管分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L的ONP溶液。以第一只试管为空白,测OD420。以ONP浓度为纵坐标,OD420为横坐标绘制标准曲线。

1.5 菌株鉴定

1.5.1 菌体形态观察 用革兰氏染色法将细胞染色后观察细菌个体形态。用已知菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)同时染色做为对照。

1.5.2 生理生化反应特征 生理生化特性测定参照《常见细菌系统鉴定手册》中的方法[24]。

1.5.3 分离菌株的16S rDNA鉴定 16S rDNA序列测定及系统发育分析采用细菌16S rDNA通用引物:27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACCT-3′)进行PCR扩增。PCR反应采用50 μL体系。反应条件:94 ℃,5 min;94 ℃,45 s;55 ℃,45 s;72 ℃,2 min,30个循环;72 ℃,10 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,切胶回收,目的片断交由睿博兴科(青岛)测序部进行测序。将测定的16S rDNA序列与GenBank中已知核酸序列进行BLSAT分析,从中获得与菌株16S rDNA 同源的序列,利用MEGA7.0 软件构建系统发育树。

1.6 乳糖酶酶学性能

1.6.1 最适反应温度与热稳定性 最适反应温度:取1 mL磷酸盐缓冲液(pH6.5)稀释的酶液,分别于30、40、50、60、70 ℃保温5 min,同时另将1 mL ONPG溶液依次在相同温度下预热5 min。将ONPG加入到相应温度的酶液中反应10 min,随后加入3 mL Na2CO3终止反应。计算各温度下的相对酶活(即各酶活与最高酶活的百分比),确定酶的最适反应温度。

酶的热稳定性:取1 mL磷酸盐缓冲液稀释的酶液,于40、50、60、65 ℃保温0、10、20、30、40、50 min,同时将1 mL ONPG溶液依次在相同温度下进行保温。将ONPG加入到粗酶液中,37 ℃反应10 min,加入3 mL Na2CO3终止反应,测OD420,以65 ℃加热失活的酶液作为空白对照,以0 min酶活为100%,计算相对酶活,测定酶的热稳定性。

1.6.2 最适pH和pH稳定性 最适pH:在最适温度条件下,按1.6.1项下方法,测定pH4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和10.0条件下酶活性。计算各pH酶活与最高酶活的百分比,确定酶最适反应pH。

pH稳定性:将酶液分别置于pH4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和10.0的缓冲溶液中,37 ℃处理18 h,测定不同pH条件下的酶活,以最高酶活为100%,计算各pH酶活与最高酶活百分比,测定酶的pH稳定性[25-26]。

1.6.3 金属离子和EDTA对酶活的影响 在酶促反应体系磷酸盐缓冲液(pH6.5)中分别加入1 mol/L的Na+、K+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+和EDTA溶液,使最终反应体系中金属离子的浓度均为1 mmol/L,测定酶活力。以不加金属离子溶液的酶活为空白对照,酶活力为100%,计算各离子存在时的相对酶活。

相对酶活(%)=各离子存在时的酶活/空白对照的酶活×100

1.7 菌株产酶稳定性

将产乳糖酶菌株接种到斜面上连续传代培养5代,每代均接种到液体发酵培养基中进行培养,并按照1.6.1项下方法进行酶活测定,测定各代的乳糖酶活力。

1.8 数据处理

利用Excel 2010及SPSS 20.0对试验数据进行处理及分析。

2 结果与分析

2.1 菌种初筛

经过挑选,从10个样品中共分离得到10株产乳糖酶菌株。菌株在初筛培养基上的菌落颜色变化情况见表1。

表1 产酶菌株菌落变色情况Table 1 Bacterial colony discoloration of enzyme producing strain

由表1可知,10株产乳糖酶菌株在初筛培养基上有3株菌落蓝色深,4株蓝色较深,3株蓝色较浅。将10株菌株接种到发酵培养基进行复筛。

2.2 菌种复筛

2.2.1 ONPG标准曲线 以吸光度OD420为横坐标,ONP浓度为纵坐标绘制乳糖酶活性标准曲线,相关系数R2=0.998(图1),说明该标准曲线可用于乳糖酶的测定。

图1 乳糖酶活性测定标准曲线Fig.1 Standard curve of lactase activity

2.2.2 产乳糖酶菌株的酶活 上述10株菌株接种于发酵培养基培养24 h后,以吸光度最低的菌株OD值0.9为标准,把各菌株培养液的OD600调节为0.9,然后利用1.3项下的方法制备粗酶液,按1.5.1项下测定酶活。各菌株酶活复筛结果如表2所示,酶活力高于3.00 U/mL的菌株有3株,低于3.00 U/mL高于1.00 U/mL的菌株有2株,低于1.00 U/mL的菌株有5株。菌株RTM-111的酶活显著高于其他菌株(p<0.05),为18.07 U/mL。近年来关于产乳糖酶细菌的报道,酶活一般在10 U/mL以下[23,25-28],Venkateswarulu等[29]报道的产乳糖酶的枯草芽孢杆菌,经条件优化后,酶活可达到15.27 U/mL。由此可见,RTM-111具有较强的产酶活力,对其进行鉴定并进行后续研究。

表2 不同菌株产乳糖酶的活力Table 2 Activity of lactase in different strains

2.3 菌株鉴定

2.3.1 形态特征 菌株RTM-111在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落边缘不规则、微黄色、表面粗糙不透明、有许多褶皱。革兰氏染色为阳性,有芽孢(如图2所示)。

图2 菌株RTM-111革兰氏染色照片(100×)Fig.2 Gram stain of strain RTM-111(100×)

2.3.2 生理生化反应 生理生化反应结果表明,RTM-111菌株V-P实验阳性,接触酶阳性,能水解酪素、淀粉和明胶,能发酵葡萄糖产酸,可发酵甘露醇、木糖、阿拉伯糖,能利用柠檬酸盐,不能利用丙酸盐,卵黄反应和吲哚产生实验阴性,硝酸盐还原实验阳性。菌株RTM-111生长特征和生理生化特性与枯草芽孢杆菌的特征吻合[24]。

表3 菌株RTM-111生理生化特征Table 3 Biological and physiological characteristics of strain RTM-111

2.3.3 16S rDNA序列测定及同源性分析 序列测定结果如图4所示,结果表明,RTM-111菌株 16SrDNA 序列全长1424 bp,其电泳结果如图3所示。将该序列进行BLAST比对分析,结果发现其与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)同源性最高,达99%。选出相关性较高的芽孢杆菌属内相关菌株的16S rDNA序列,用MEGA7.0构建系统发育树,结果显示其与Bacillussubtilis聚为一族(图4)。结合理化反应特征及分子鉴定结果,确定RTM-111为枯草芽孢杆菌,命名为BacillussubtilisRTM-111。枯草芽孢杆菌是一种重要的益生菌,是美国FDA及我国卫生部都认定的安全菌种[30],已被广泛应用于农业、工业、食品、医药、卫生、水产、畜牧业及科研等诸多领域[31-33],因此食源性RTM-111可保证乳糖酶的安全性。

图3 RTM-111菌株16S rDNA琼脂糖凝胶电泳Fig.3 Agarosegel electrophoresis of 16S rDNA from RTM-111

图4 RTM-111与相关菌株系统进化树Fig.4 Evolutionary tree of RTM-111 and related strains

2.4 乳糖酶酶学性能研究

2.4.1 最适反应温度与热稳定性 酶的最适反应温度是酶的重要性能,工业生产中一般要求乳糖酶的最适温度达37 ℃或更高[34]。以横坐标为温度,纵坐标为相对酶活绘图,反应温度对RTM-111菌产生的乳糖酶活力的影响如图5所示。结果表明,酶活性随温度升高而先增加后减少,40 ℃酶活上升到较高水平(最高值的86.8%),50 ℃酶活最高(21.52 U/mL),60 ℃之后酶活快速下降,至70 ℃相对酶活已降至10%以下。由此可以确定菌株RTM-111乳糖酶的最适温度为50 ℃。

图5 反应温度对RTM-111菌产生的乳糖酶活力的影响Fig.5 Effect of temperature on activity of lactase produced by RTM-111

乳糖酶热稳定性实验如图6所示,结果表明乳糖酶在40 ℃和50 ℃稳定性好,保温40 min,相对酶活仍保持在80%以上,说明该酶在最适酶活温度下具有良好的稳定性,具有潜在的应用价值。在60 ℃及以上温度,酶的稳定性急剧下降,保温至30 min时酶活下降到10%以下,说明该酶不耐高温。

图6 乳糖酶的热稳定性Fig.6 Thermal stability of lactase

2.4.2 最适pH和pH稳定性 最适pH结果如图7所示,RTM-111菌株所得酶液在酸性条件下酶活较低,随pH的增加活性逐渐增强,在pH7.5时达最高值,最后活性逐渐减弱,由此确定该酶的最适pH为7.5。乳糖酶最适pH决定了其用途不同,霉菌产生的乳糖酶最适pH偏酸性(pH2.5～5.0),可应用于酸性乳清和奶酪的水解;而酵母菌和细菌所产乳糖酶最适pH近中性(分别为pH6～7和pH6.5～7.5),适于牛乳和鲜乳清的水解[9,35-36]。该结果说明RTM-111在乳制品水解领域具有应用价值。

图7 pH对RTM-111菌产生的乳糖酶活力的影响Fig.7 Effect of pH on activity of lactase produced by RTM-111

乳糖酶的pH稳定性结果表明,在pH6.5～8.0范围内,维持18 h,乳糖酶酶活性较高(86.7%～100%),说明该酶在最适pH条件下具有较高的稳定性,具有潜在的应用价值(图8)。

图8 酶的pH稳定性Fig.8 pH stability of the enzyme

2.4.3 金属离子和EDTA对酶活的影响 金属离子会对酶活产生激活或抑制作用,如图9所示,Na+、Mg2+和Mn2+对酶活有较明显激活作用,K+、Ca2+对酶活无明显作用,Cu2+和Zn2+对酶活具有显著抑制作用,EDTA对乳糖酶活具有完全抑制作用。Rahim等研究嗜冷枯草芽孢杆菌所产生的乳糖酶发现,Na+和K+对酶有激活作用,Ca2+有部分抑制作用,Cu2+和Zn2+有完全抑制作用[37]。而Lara等获得的枯草芽孢杆菌产生的乳糖酶,能够明显被Cu2+和Zn2+所抑制,而对Mg2+、Mn2+和Ca2+不敏感[38]。这些与我们所研究的乳糖酶有区别,说明即使来源于同种不同株的微生物所产生的乳糖酶,其酶学性质也会有区别。上述结果可作为酶活性调节与控制的理论依据。

图9 金属离子和EDTA对乳糖酶活力的影响Fig.9 Effect of metalic ions and EDTA on enzyme activity

2.5 菌株产酶稳定性

枯草芽孢杆菌RTM-111每代产乳糖酶结果如表4所示,传代培养5次,酶活变化幅度很小,差异不显著(p>0.05),说明该菌株产酶能力稳定。

表4 RTM-111菌株产酶稳定性Table 4 Stability of RTM-111 for enzyme production

3 结论

本实验从藏区牦牛奶酪制品中分离筛选出得到一株高产乳糖酶菌株RTM-111,综合形态学、理化反应特征及16S rDNA序列分析,将其鉴定为枯草芽孢杆菌。对RTM-111所产酶的酶学性质研究表明,该酶最适反应温度为50 ℃,且在 40～50 ℃具有很强的稳定性,说明其在高酶活区能够保持稳定的性能,具备良好的生产潜力。该酶的最适pH为7.5,在pH6.5～8.0条件下稳定性较高,适于牛乳和乳清的水解。金属离子对酶活的研究表明,Na+、Mg2+和Mn2+对酶活性具有较强的激活作用,使用时可适当添加以作为酶的激活剂;而Cu2+、Zn2+和EDTA对酶活有显著的抑制作用,使用时应控制这些离子的浓度。且连续传代培养后,枯草芽孢杆菌RTM-111产酶能力稳定。总之,本研究所得枯草芽孢杆菌RTM-111所产乳糖酶与以往枯草芽孢杆菌乳糖酶性质不同,具有新颖性且具有较好的应用潜力,为进一步开发利用乳糖酶提供了理论依据。